Primjena metode elektronske paramagnetske rezonancije u istraživanju ulja i dispergirane organske tvari. Elektronska paramagnetska rezonancija. EPR metoda. Primjena Elektronička rezonancija
EPR
Princip EPR metode
Povijest otkrića EPR metode
EPR metoda je glavna metoda za proučavanje paramagnetskih čestica prisutnih u biološkim sustavima. Paramagnetskim česticama koje imaju važnu biološki značaj Postoje dvije glavne vrste veza - to suslobodni radikali I metali promjenljive valencije (kao što je Fe, Cu, Co, Ni, Mn) ili njihovih kompleksa. Osim stanja slobodnih radikala, metodom EP proučavaju se i tripletna stanja koja nastaju tijekom fotobioloških procesa.
Metoda elektronske paramagnetske rezonancije otkrivena je relativno nedavno - u 1944. godine . na Sveučilištu u Kazanu Evgeniy Konstantinovich ZAVOYSKY u proučavanju apsorpcije elektromagnetske energije od strane paramagnetskih metalnih soli. Primijetio je da monokristal CuCl 2, postavljen u konstantno magnetsko polje od 40 Gaussa (4 mT) počinje apsorbirati mikrovalno zračenje s frekvencijom od oko 133 MHz.
Pioniri korištenja EPR-a u biološkim istraživanjima u SSSR-u bili su L.A. Blumenfeld i A.E. Kalmanson, koji je 1958. u časopisu Biophysics objavio članak o proučavanju slobodnih radikala nastalih djelovanjem ionizirajućeg zračenja na proteine.
Mehanički i magnetski momenti elektrona
Orbitalno i spinsko gibanje elektrona leži u osnovi njihovih orbitalnih i spinskih mehaničkih momenta. Orbitalni kutni moment količine gibanja elektrona R radijus orbite R jednako:
Gdje ja - jakost struje u krugu, i S - područje konture (u ovom slučaju, kružna orbita je jednaka pR2 ). Zamjenom izraza za površinu u formulu (2) i uzimajući u obzir da:
Uspoređujući izraze za mehanički i magnetski moment elektrona (1) i (4), možemo napisati da je:
Gdje n - orbitalni kvantni broj, uzimajući vrijednosti 0, 1, 2 i m U ovom slučaju, uzimajući u obzir (6), izraz za magnetski orbitalni moment će izgledati ovako:
Spinski magnetski moment elektrona povezan je sa spinskim gibanjem elektrona, koje se može prikazati kao gibanje oko vlastite osi. Spin mehanički moment elektrona jednak je:
|
|
Gdje S - kvantni broj spina jednak 1/2 .
Magnetski i mehanički spin momenti povezani su relacijom:
|
| (10) |
Gdje MS
- magnetski kvantni broj jednak +1/2
. Omjer magnetskog momenta i mehaničkog momenta naziva se žiromagnetski omjer ( g
). Može se vidjeti da za orbitalno kretanje: 
, a za spin: 
Za žiromagnetski omjer elektrona koji imaju različite doprinose orbitalnog i spinskog gibanja, uvodi se koeficijent proporcionalnosti g
, tako da:
|
| (11) |
Taj se faktor proporcionalnosti naziva g -faktor. g =1, na S =0, tj. kada nema spinskog gibanja elektrona i postoji samo orbitalno gibanje, i g =2 ako nema orbitalnog gibanja i postoji samo spinsko gibanje (na primjer, za slobodni elektron).
Magnetski moment elektrona sastoji se u općem slučaju odspin i orbitalamagnetski momenti. Međutim, u većini slučajeva, orbitalni magnetski moment je nula. Stoga, kada se raspravlja o principu metode ýïð, samospinski magnetski moment.
Zeemanov učinak
Energija međudjelovanja između magnetskog momenta elektrona i magnetskog polja izražava se jednadžbom:
| (12) |
Gdje m N - napetost magnetsko polje,cos( mH ) - kosinus kuta između m I N .
Zeemanov efekt (slika 1) ( ES =+1/2 I ES =-1/2 )
Iz jednadžbe (11) slijedi da je:
U ovom slučaju, razlika u energiji između dvije razine bit će:
|
| (15) |
Jednadžba (14) opisuje Zeemanov učinak, koji se može izraziti sljedećim riječima:Energetske razine elektrona postavljenih u magnetsko polje dijele se u ovom polju ovisno o veličini spinskog magnetskog momenta i intenzitetu magnetskog polja.
Osnovna jednadžba rezonancije
Broj elektrona koji imaju određenu energiju odredit će se u skladu s Boltzmannovom distribucijom, naime: ,
Ako se elektromagnetska energija sada primijeni na sustav elektrona smještenih u magnetskom polju, tada će se pri određenim vrijednostima energije upadnog kvantnog elektrona dogoditi prijelazi između razina. Neophodan uvjet prijelaza je jednakost energije upadnog kvanta ( hn ) energetske razlike između razina elektrona s različitim spinovima ( gbH ).
|
| (17) |
Jednadžba (17) izražava osnovni uvjet za apsorpciju energije od strane elektrona. Pod utjecajem zračenja elektroni koji se nalaze na višoj energetskoj razini će emitirati energiju i vratiti se na nižu razinu, ova pojava se nazivainducirana emisija.
Elektroni koji se nalaze na nižoj razini će apsorbirati energiju i prijeći na višu energetsku razinu, ovaj fenomen se nazivarezonantna apsorpcija. Budući da su vjerojatnosti pojedinačnih prijelaza između energetskih razina jednake, a ukupna vjerojatnost prijelaza proporcionalna broju elektrona koji se nalaze na danoj energetskoj razini, tadaapsorpcija energije će prevladati nad njezinom emisijom . To je zbog činjenice da je, kao što proizlazi iz jednadžbe (16), naseljenost niže energetske razine veća od naseljenosti gornje energetske razine.
Ovdje treba istaknuti poseban položaj slobodnih radikala, tj. molekule koje imaju nesparene elektrone u vanjskoj elektronskoj orbitali, u distribuciji elektrona po energetskim razinama. Ako postoji upareni broj elektrona u orbitali, tada će prirodno naseljenost energetskih razina biti ista i količina energije koju elektroni apsorbiraju bit će jednaka količini emitirane energije.
Apsorpcija energije tvari koja se nalazi u magnetskom polju bit će primjetna samo u slučaju kada se u orbiti nalazi samo jedan elektron, tada se može govoriti oBoltzmannova distribucijaelektrona između energetskih razina.
Karakteristike EPR spektara
Amplituda signala
Za određivanje koncentracije mjere se površine ispod apsorpcijske krivulje standarda s poznatom koncentracijom paramagnetskih centara u uzorku koji se mjeri i nepoznate koncentracije; dobiveno iz udjela, pod uvjetom da oba uzorka imaju isti oblik i volumen:
|
| (18) |
Gdje C promijeniti I C ovaj. - koncentracije izmjereni uzorak i standard, i S promijeniti I S ovaj. - područje ispod apsorpcijskih linija mjerenog signala i standarda.
Za određivanje površine ispod apsorpcijske linije nepoznatog signala, možete koristiti tehniku numeričke integracije:
Gdje f(H) - prvi izvodapsorpcijske linije (EPR spektar), F(H) - funkcija apsorpcijske linije, i H - napetost magnetsko polje.
Gdje f"(H) - prva derivacija apsorpcijske linije, odn EPR spektar . S obzirom na to, lako je prijeći od integrala do interkalnog zbroja H=n*DH , dobivamo:
|
| (21) |
Gdje D.H. je korak promjene magnetskog polja, i n i - broj koraka.
Stoga će površina ispod krivulje apsorpcije biti jednaka umnošku kvadrata veličine koraka magnetskog polja i zbroja umnožaka amplitude EPR spektra i broja koraka. Iz izraza (21) lako je vidjeti da za velike n (tj. daleko od središta signala), doprinos udaljenih dijelova spektra može biti prilično velik čak i pri malim vrijednostima amplitude signala.
Oblik linije
Iako prema osnovnoj jednadžbi rezonancije do apsorpcije dolazi samo kada je energija upadnog fotona jednaka razlici energije između razina nesparenih elektrona, EPR spektar nije linijast, već stalan u nekoj blizini točke rezonancije. Poziva se funkcija koja opisuje EPR signalfunkcija oblika linije . U razrijeđenim otopinama, kada se interakcija između paramagnetskih čestica može zanemariti, apsorpcijska krivulja opisuje se Lorentzovom funkcijom:
Gaussova funkcija je omotnica EPR spektar ako postoji međudjelovanje između paramagnetskih čestica. Uzimanje u obzir oblika crte posebno je važno pri određivanju površine ispod apsorpcijske krivulje. Kao što se može vidjeti iz formula (22) i (23), Lorentzova funkcija ima sporiji pad i, sukladno tome, šira krila, što može dati značajnu pogrešku pri integraciji spektra.
Širina linije
Širina EPR spektra ovisi o interakciji magnetskog momenta elektrona s magnetskim momentima okolnih jezgri(rešetke) i elektrona.
Razmotrimo detaljnije mehanizam apsorpcije energije od strane nesparenih elektrona. Ako u niskoenergetskom stanju postoji N 1 elektrona, a u visokoenerg N 2 i N još 1 N 2, onda kada se elektromagnetska energija dovede u uzorak, razlika u populaciji razina će se smanjivati sve dok ne postane jednaka nuli.
To se događa jer su vjerojatnosti jednog prijelaza pod utjecajem zračenja iz niskoenergetskog stanja u visokoenergetsko stanje i obrnuto ( W 12 i W 21) su međusobno jednaki, a stanovništvo niže razine je više. Uvedimo varijablu n =N 1 -N 2. Tada se promjena razlike u populaciji razine tijekom vremena može napisati:
I 
; gdje
| (24) |
Međutim, u eksperimentu nije uočena promjena u populacijskoj razlici razina zbog činjenice da postoje relaksacijski procesi koji ovu razliku održavaju konstantnom. Mehanizam opuštanja sastoji se od prijenosa kvanta elektromagnetske energije na rešetku ili okolne elektrone i vraćanja elektrona na niskoenergetsku razinu
Označimo li vjerojatnosti prijelaza izazvanih rešetkom sa P 12 i P 21, i P 12 manje P 21, tada će promjena u populacijskoj razlici razine biti:
U stacionarnom stanju, kada je promjena u populacijskoj razlici nula, početna razlika u populaciji razina ( n 0) ostaje konstantan i jednak:
Ili zamjena P 12 +P 21 dalje 1/T 1, dobivamo
|
| (29) |
Veličina T 1 se zovespin-lattice relaksacijsko vrijemei karakterizira prosječni životni vijek spinskog stanja. Kao rezultat toga, promjena razlike naseljenosti između razina sustava nesparenih elektrona pod utjecajem elektromagnetskog zračenja i interakcije s rešetkom bit će određena jednadžbom:
I kada 2WT 1 mnogo manje 1 , n = n 0, tj. pri relativno malim snagama razlika u naseljenosti razine praktički ostaje konstantno . Iz Heisenbergove relacije nesigurnosti slijedi da je:
|
| (32) |
Ako to prihvatimo Dt jednaki T 1, a DE odgovara gbDH , tada se jednadžba (32) može prepisati kao:
|
| (33) |
Oni. nesigurnost u širini linije je obrnuto proporcionalna vremenu opuštanja spin-rešetke.
Osim međudjelovanja magnetskog momenta nesparenog elektrona s rešetkom, moguće je i njegovo međudjelovanje s magnetskim momentima drugih elektrona. Ova interakcija dovodi do smanjenja vremena relaksacije i time do širenja linije EPR spektra. U ovom slučaju uvodi se koncept vremena spin-spin relaksacije ( T 2). Promatrano vrijeme relaksacije smatra se zbrojem vremena spin-rešetke i spin-spin vremena relaksacije.
Za slobodne radikale u otopinama T 1 mnogo manje T 2, stoga će se odrediti širina linije T 2. Među mehanizmima za proširenje linije treba spomenuti sljedeće:dipol-dipol interakcija; anizotropija g-faktora; dinamičko širenje linije i izmjena spina .
Interakcija dipol-dipol temelji se na interakciji magnetskog momenta nesparenog elektrona s lokalnim magnetskim poljem koje stvaraju susjedni elektroni i jezgre. Jačina magnetskog polja u bilo kojoj točki ovisi o udaljenosti do te točke i relativnoj orijentaciji magnetskih momenata nesparenog elektrona i drugog elektrona ili jezgre u interakciji. Promjena energije nesparenog elektrona bit će određena:
| (34) |
Gdje m - magnetski moment elektrona, R - udaljenost od izvora lokalnog magnetskog polja, q - kut između međusobno djelujućih magnetskih momenata.
Doprinos anizotropije g -faktor širenja EPR linije je zbog činjenice da orbitalno gibanje elektrona stvara izmjenično magnetsko polje s kojim interagira magnetski moment spina. Ova interakcija dovodi do odstupanja g - faktor vrijednosti 2,0023 , odgovaraslobodni elektron.
Za kristalne uzorke veličine g -faktori koji odgovaraju orijentaciji kristala označavaju g xx, g yy i g zz odnosno. Kada se molekule brzo kreću, na primjer u otopinama, anizotropija g -faktor se može usrednjiti.
Proširenje EPR signala može biti posljedica međusobne transformacije dvaju oblika radikala. Dakle, ako svaki od oblika radikala ima svoj vlastiti EPR spektar, tada će povećanje brzine međusobne transformacije ovih oblika jednih u druge dovesti do širenja linija, jer U isto vrijeme, životni vijek radikala u svakom stanju se smanjuje. Ova promjena širine signala naziva sedinamičko širenje signala. Izmjena spinova je još jedan način za proširenje EPR signala. Mehanizam širenja signala tijekom izmjene spina sastoji se u promjeni smjera magnetskog momenta spina elektrona u suprotnom kada se on sudari s drugim nesparenim elektronom ili drugim paramagnetom.
Budući da takav sudar smanjuje životni vijek elektrona u danom stanju, EPR signal je proširen. Najčešći slučaj širenja EPR linije mehanizmom spinske izmjene je širenje signala u prisutnosti kisika ili paramagnetskih metalnih iona.
Ultrafina struktura
Cijepanje EPR linije na nekoliko temelji se na fenomenu hiperfine interakcije, tj. interakcije magnetskih momenata nesparenih elektrona ( M S) s magnetskim momentima jezgri ( M N).
|
| Budući da je u prisustvu magnetskog momenta jezgre ukupni magnetski moment jednak M S+ M N, gdje M S je magnetski moment elektrona, i M N je magnetski moment jezgre, zatim ukupno magnetsko polje N iznosi = N 0 ± N lok. , Gdje N lok. - lokalno magnetsko polje koje stvara magnetski moment jezgre. |
Važna značajka hiperfine interakcije su pravila odabira za prijelaze između razina. Dopušteni prijelazi su prijelazi u kojima se mijenja spinski magnetski moment nesparenog elektrona ( DM S) jednako 1 , i magnetski moment spina jezgre ( DM N) jednako 0 .
U primjeru koji smo razmatrali, spin jezgre u interakciji s nesparenim elektronom bio je polucijeli broj i jednak ± 1/2, što nam je na kraju dalo podjelu u dvije linije. Ova vrijednost spina tipična je za protoni . Na jezgri atoma dušika ( N 14) spin je cijeli broj. Može poprimiti vrijednosti ±1 I 0 . U ovom slučaju, kada nespareni elektron komunicira s jezgrom atoma dušika, primijetit će se cijepanje u tri identične linije koje odgovaraju vrijednosti spina +1 , -1 I 0 . Općenito, broj linija u EPR spektru je jednak 2M N+ 1 .
Naravno, broj nesparenih elektrona i, sukladno tome, površina ispod EPR apsorpcijske krivulje ne ovise o vrijednosti nuklearnog spina i konstantne su vrijednosti. Posljedično, kada se jedan EPR signal podijeli na dva ili tri, intenzitet svake komponente bit će, redom, 2 ili 3 puta niže.
Vrlo slična slika nastaje ako nespareni elektron stupa u interakciju ne s jednom, već s nekoliko ekvivalentnih (s istom konstantom hiperfine interakcije) jezgri koje imaju magnetski moment različit od nule, na primjer, dva protona. U tom slučaju nastaju tri stanja koja odgovaraju orijentaciji protonskih spinova:
1. oba preko polja,
2. oba protiv polja
3. jedan niz polje i jedan protiv terena.
Opcija 3 dvostruko je vjerojatnije od 1 ili 2 , jer može se izvesti na dva načina. Kao rezultat takve raspodjele nesparenih elektrona, jedna linija će se podijeliti na tri s omjerom intenziteta 1:2:1 . Općenito, za n ekvivalentne jezgre sa spinom M N broj linija je 2nM N+ 1 .
Dizajn EPR radiospektrometra
Dizajn EPR radiospektrometra umnogome je sličan spektrofotometru za mjerenje optičke apsorpcije u vidljivom i ultraljubičastom dijelu spektra.
Izvor zračenja u radiospektrometru je klistron, koji je radio cijev koja proizvodi monokromatsko zračenje u centimetarskom području valnih duljina. Dijafragma spektrofotometra u radiospektrometru odgovara atenuatoru koji vam omogućuje doziranje snage koja pada na uzorak. Kiveta s uzorkom u radiospektrometru nalazi se u posebnoj jedinici koja se naziva rezonator. Rezonator je paralelopiped s cilindričnom ili pravokutnom šupljinom u kojoj se nalazi apsorbirajući uzorak. Dimenzije rezonatora su takve da se u njemu stvara stojni val. Element koji nedostaje u optičkom spektrometru je elektromagnet koji stvara konstantno magnetsko polje potrebno za cijepanje energetskih razina elektrona.
Zračenje koje je prošlo kroz mjereni uzorak, u radiospektrometru i spektrofotometru, pogađa detektor, zatim se signal detektora pojačava i snima na snimaču ili računalu. Treba napomenuti još jednu razliku radiospektrometra. Leži u činjenici da se zračenje radijskog raspona prenosi od izvora do uzorka, a zatim do detektora pomoću posebnih pravokutnih cijevi koje se nazivaju valovodima. Dimenzije poprečnog presjeka valovoda određene su valnom duljinom propuštenog zračenja. Ova značajka prijenosa radio emisije kroz valovode određuje činjenicu da se za snimanje EPR spektra u radio spektrometru koristi konstantna frekvencija zračenja, a stanje rezonancije postiže se promjenom veličine magnetskog polja.
Još jedan važna značajka Radiospektrometar pojačava signal modulirajući ga visokofrekventnim izmjeničnim poljem. Kao rezultat modulacije signala, on se diferencira i apsorpcijska linija se pretvara u svoju prvu derivaciju, a to je EPR signal.
EPR signali promatrani u biološkim sustavima
Korištenje EPR metode u biološkim istraživanjima povezano je s proučavanjem dvije glavne vrste paramagnetskih centara - slobodnih radikala i metalnih iona promjenjive valencije. Proučavanje slobodnih radikala u biološkim sustavima povezano je s teškoćom koja leži u niskoj koncentraciji slobodnih radikala nastalih tijekom života stanica. Koncentracija radikala u stanicama koje normalno metaboliziraju je različiti izvori približno 10 -8 - 10 -10 M , dok moderni radiospektrometri omogućuju mjerenje koncentracija radikala 10 -6 - 10 -7 M .
Koncentraciju slobodnih radikala možete povećati usporavanjem njihove smrti i povećanjem brzine njihovog stvaranja. To se može učiniti zračenjem (UV ili ionizirajuće zračenje) bioloških objekata na niskim temperaturama.
Proučavanje strukture radikala više ili manje složenih biološki važnih molekula bilo je jedno od prvih područja primjene EPR metode u biološkim istraživanjima.
EPR spektri UV-ozračenog cisteina
EPR spektar jetre štakora
Drugo važno područje primjene EPR metode u biološkim istraživanjima bilo je proučavanje metala promjenjive valencije i/ili njihovih kompleksa koji postojein vivo.
Ako pogledate EPR spektar, na primjer, jetre štakora, možete vidjeti signale citokroma R-450 imajući g -faktor 1,94 I 2,25 , signal methemoglobina sa g -faktor 4,3 i signal slobodnih radikala koji pripada semikinon radikalima askorbinske kiseline i flavina s g -faktor 2,00 .
Zbog kratkog vremena relaksacije, EPR signali metaloproteina mogu se promatrati samo na niskim temperaturama, na primjer, na temperaturi tekućeg dušika.
Međutim, EPR signali nekih radikala mogu se promatrati i na sobnoj temperaturi. Ovi signali uključuju EPR signale mnogih semikinon ili fenoksil radikala, kao što su semikinon radikal ubikinona, fenoksil i semikinon radikali a-tokoferola (vitamin E), vitamin A D, i mnogi drugi.
ELEKTRONIČKA PARAMAGNETSKA REZONANCIJA (EPR)- rezonantna apsorpcija Elektromagnetski valovi tvari koje sadrže paramagnetske čestice. Metode temeljene na EPR-u našle su široku primjenu u laboratorijskoj praksi. Uz njihovu pomoć proučavaju kinetiku kemijskih i bioloških kemijske reakcije(vidi Kinetika bioloških procesa, Kemijska kinetika), uloga slobodnih radikala u vitalnim procesima organizma u normalnim uvjetima i u patologiji (vidi Slobodni radikali), mehanizmi nastanka i tijeka fotobioloških procesa (vidi Fotobiologija) itd. .
Fenomen EPR otkrio je sovjetski znanstvenik B. K. Zavoisky 1944. godine. Elektronička paramagnetska rezonancija karakteristična je samo za paramagnetske čestice, odnosno čestice koje se mogu magnetizirati kada se na njih primijeni magnetsko polje) s nekompenziranim elektronskim magnetskim momentom, koji je pak posljedica mehaničkog momenta samog elektrona - spina. Elektrone karakterizira posebna vrsta unutarnjeg gibanja, koje se može usporediti s rotacijom vrha oko svoje osi. Kutni moment povezan s njim naziva se spin. Zahvaljujući spinu, elektron ima stalni magnetski moment usmjeren suprotno od spina. U većini molekula elektroni su smješteni u orbitalama na način da su im spinovi suprotno usmjereni, magnetski momenti su kompenzirani i EPR signal iz njih se ne može promatrati. Ako magnetsko polje elektrona nije kompenzirano spinom drugog elektrona (to jest, molekula sadrži nesparene elektrone), tada se bilježi ESR signal. Čestice s nesparenim elektronima su slobodni radikali, ioni mnogih metala (željezo, bakar, mangan, kobalt, nikal itd.), niz slobodnih atoma (vodik, dušik, alkalijski metali itd.).
U nedostatku vanjskog magnetskog polja, smjer (orijentacija) magnetskog momenta elektrona u prostoru može biti bilo koji; energija takvog elektrona ne ovisi o orijentaciji njegovog magnetskog momenta. U skladu sa zakonima kvantne mehanike, u vanjskom magnetskom polju orijentacija magnetskog momenta elektrona ne može biti proizvoljna - može biti usmjerena ili u smjeru magnetskog polja ili suprotno od njega.
U skladu s orijentacijom magnetskog momenta elektrona, njegova energija u magnetskom polju također može poprimiti samo dvije vrijednosti: najmanju E1 - kada je magnetski moment usmjeren "duž polja" i maksimalnu E2 - kada je usmjeren “protiv polja” i razlika u energijama tih stanja (delta E ) izračunava se po formuli: ΔE = gβH, gdje je β Bohrov magneton (mjerna jedinica magnetskog momenta elektrona), H je jakost magnetskog polja, g je konstanta koja ovisi o elektronskoj strukturi paramagnetske čestice. Ako se sustav nesparenih elektrona u vanjskom magnetskom polju izloži elektromagnetskom zračenju čija je kvantna energija jednaka ΔE, tada će pod utjecajem zračenja elektroni početi prelaziti iz stanja s nižom energijom u stanje s većom. energije, što će biti popraćeno apsorpcijom zračenja od strane tvari.
EPR se svrstava u radiospektroskopsku metodu, budući da se za promatranje elektronske paramagnetske rezonancije koristi zračenje u radiofrekvencijskom području elektromagnetskih valova.
EPR se snima pomoću posebnih instrumenata - radio spektrometara. Oni uključuju: elektromagnet, izvor radiofrekventnog zračenja, liniju za prijenos zračenja od izvora do uzorka (valovod), rezonator u kojem se nalazi uzorak koji se proučava, sustave za detekciju, pojačanje i snimanje signala. Najčešći radiospektrometri koriste elektromagnetsko zračenje valnih duljina od 3,2 cm ili 8 mm.
EPR signal se snima na sljedeći način. Jakost magnetskog polja koje stvara elektromagnet linearno varira unutar određenih granica. Pri vrijednostima napona koje odgovaraju stanju rezonancije, uzorak apsorbira energiju elektromagnetskog zračenja. Apsorpcijska linija (EPR signal) predstavlja ovisnost snage zračenja koju apsorbira uzorak o jakosti magnetskog polja. U postojećim radiospektometrima EPR signal se bilježi u obliku prve derivacije apsorpcijske linije.
Za opisivanje i analizu EPR spektara koristi se niz parametara koji karakteriziraju intenzitet linija, njihovu širinu, oblik i položaj u magnetskom polju. Intenzitet EPR linija, uz ostale uvjete, proporcionalan je koncentraciji paramagnetskih čestica, što omogućuje kvantitativnu analizu.
Kada se razmatra fenomen EPR-a, treba uzeti u obzir da magnetski moment nesparenog elektrona djeluje ne samo s magnetskim poljem elektromagneta, već i s magnetskim poljima koja stvara okolina elektrona: drugi nespareni elektroni, magnetske jezgre (vidi Nuklearna magnetska rezonancija). Interakcija nesparenih elektrona s jezgrama često dovodi do cijepanja EPR spektra u nekoliko linija. Analiza takvih spektara omogućuje prepoznavanje prirode paramagnetskih čestica i procjenu prirode i stupnja njihove međusobne interakcije.
Sudjelovanje paramagnetskih čestica u kemijskim reakcijama, molekularno gibanje i drugi kinetički učinci također utječu na oblik EPR spektra. Stoga se EPR koristi za detekciju, procjenu količine i identifikaciju paramagnetskih čestica, proučavanje kinetike kemijskih i biokemijskih reakcija te molekularne dinamike.
Zbog svoje svestranosti EPR ima široku primjenu u raznim područjima znanosti. Upotreba EPR-a u biologiji i medicini je zbog prisutnosti u stanicama, tkivima i biol. tekućine paramagnetskih centara različite prirode. Pomoću ESR-a otkrivena je prisutnost slobodnih radikala u gotovo svim životinjskim i biljnim tkivima. Izvor slobodnih radikala su spojevi poput flavina, koenzima Q i drugih tvari koje djeluju kao prijenosnici elektrona u reakcijama energetskog metabolizma u biljnim i životinjskim stanicama; paramagnetski centri koji se nalaze u izoliranim tkivima uglavnom pripadaju lancima transporta elektrona mitohondrija, mikrosoma i kloroplasta (vidi Respiracija). Utvrđeno je da sadržaj slobodnih radikala u tkivima korelira s njihovom metaboličkom aktivnošću. Brojne studije pokazale su promjenu u količini slobodnih radikala u različitim patološkim stanjima, na primjer, tijekom onkogeneze (vidi), razvoj oštećenja zračenjem (vidi), toksikoze (vidi Intoksikacija), što se objašnjava kršenjem energetskog metabolizma. u patologiji (vidi Bioenergetika).
Pomoću ESR-a određuju se paramagnetski ioni (željezo, bakar, mangan, kobalt itd.) u tkivima životinja i biljaka, koji su dio metaloproteina uključenih u reakcije prijenosa elektrona duž elektron-transportnih lanaca i enzimatske katalize, kao i u kisiku -noseći pigmente (hemoglobin). Pomoću EPR-a moguće je proučavati redoks transformacije metalnih iona i prirodu interakcije iona s njihovom okolinom, što omogućuje utvrđivanje fine strukture kompleksa koji sadrže metal.
Patološke promjene u tkivima dovode do promjena u ESR signalima metaloproteina, što je povezano s raspadom paramagnetskih metalnih kompleksa, promjenama u okruženju paramagnetskih iona i prijelazom iona u druge komplekse. Međutim, proučavanje prirode paramagnetskih središta tkiva, posebice slobodnih radikala, povezano je s određenim poteškoćama zbog poteškoća u dešifriranju EPR spektara.
Uz pomoć EPR-a bilo je moguće proučavati mehanizme enzimskih reakcija (vidi Enzimi). Konkretno, moguće je istovremeno proučavati i kinetiku stvaranja i potrošnje slobodnih radikala tijekom enzimskih reakcija i kinetiku redoks transformacija metala koji čine enzime, što omogućuje utvrđivanje slijeda faza enzimatsku reakciju.
Primjena EPR-a u proučavanju ozljeda zračenjem u biol. objekata omogućuje dobivanje informacija o prirodi radikala nastalih u biopolimerima, o mehanizmima i kinetici radikalskih reakcija koje se razvijaju u ozračenim objektima i dovode do biološkog učinka. EPR metoda može se koristiti u hitnoj dozimetriji, na primjer, u slučaju slučajnog izlaganja ljudi za procjenu doze zračenja, koristeći objekte iz zone zračenja.
EPR zauzima važno mjesto u proučavanju fotobioloških procesa koji se odvijaju uz sudjelovanje slobodnih radikala (vidi Molekula, Slobodni radikali, Fotobiologija, Fotosenzibilizacija). Uz pomoć EPR-a detaljno se proučavaju procesi stvaranja slobodnih radikala u proteinima, nukleinskim kiselinama i njihovim komponentama pod utjecajem ultraljubičastog zračenja, te uloga tih radikala u fotodestrukciji biopolimera (vidi Svjetlost). Korištenje EPR-a pružilo je važne informacije o primarnim mehanizmima fotosinteze (vidi). Pokazalo se da je primarna reakcija fotosinteze prijenos elektrona iz svjetlom pobuđene molekule klorofila i stvaranje kationskog radikala klorofila. Također je identificirana priroda molekula koje prihvaćaju elektron doniran od pobuđene molekule klorofila.
ESR se također koristi za proučavanje strukture biološki važnih makromolekula i biomembrana. Na primjer, ioni željeza koji su dio hema u proteinima koji sadrže hem mogu biti u stanju visokog spina (elektroni u vanjskim orbitama nisu upareni, ukupni spin je maksimalan) i niskog spina (vanjski elektroni su potpuno ili djelomično uparen, spin je minimalan). Istraživanja značajki EPR signala visokospinskih i niskospinskih stanja iona željeza u hemoglobinu i njegovim derivatima pridonijela su razumijevanju prostorne strukture molekule hemoglobina.
Značajan napredak u proučavanju strukture biomembrana i biopolimera postignut je nakon pojave spin probe i metoda označavanja (vidi Biološke membrane). Stabilni nitroksilni radikali uglavnom se koriste kao spinske oznake i sonde (vidi Slobodni radikali). Nitroksilni radikal može biti kovalentno vezan za molekule (spinska oznaka) ili zadržan u sustavu koji se proučava zbog fizičkih interakcija (spinska sonda). Suština je u tome da oblik EPR spektra nitroksilnih radikala ovisi o svojstvima mikrookruženja: viskoznosti, prirodi i molekularnom gibanju, lokalnim magnetskim poljima itd. Spinske oznake kovalentno vezane na različite skupine biopolimera pokazatelj su stanja strukture biopolimera. Pomoću spinskih oznaka proučava se prostorna struktura biopolimera, strukturne promjene proteina tijekom denaturacije, stvaranje enzim-supstrata, kompleksa antigen-protutijelo itd.
Metodom spin probe proučavaju se načini pakiranja i pokretljivost lipida u biomembranama, lipidno-proteinske interakcije, strukturni prijelazi u membranama uzrokovani djelovanjem različitih tvari itd. Na temelju proučavanja spinskih oznaka i sondi, metode za određivanje lijekova u biol. tekućine, a proučavaju se i pitanja usmjerenog transporta droga i dr.
Dakle, uz pomoć EPR-a, široka distribucija elektroničkih procesa u tijelu prikazana je normalno iu slučaju bilo kakve patologije. Stvaranje teorije i usavršavanje tehnologije EPR metode činilo je temelj kvantne elektronike kao grane znanosti i dovelo do stvaranja molekularnih generatora i pojačivača radiovalova (masera) i svjetlosnih lasera (vidi), koji našli su široku primjenu u mnogim područjima nacionalnog gospodarstva.
Blumenfeld L. A., Voevodsky V. V. i Semenov A. G. Primjena elektronske paramagnetske rezonancije u kemiji, Novosibirsk, 1962, bibliogr.; Wertz J. i Bolton J. Teorija i praktične primjene EPR metode, trans. s engleskog M., 1975, bibliogr.; Ingram D. Elektronska paramagnetska rezonancija u biologiji, trans. s engleskog M., 1972; Kalmanson A.E. Primjena metode elektronske paramagnetske rezonancije u biokemiji, u knjizi: Usp. biol. kem., ur. B. N. Stepanenko, svezak 5, str. 289, M., 1963; Kuznetsov A. N. Metoda spin probe. M., 1976.; Lichtenstein G.I. Metoda spinskih oznaka u molekularnoj biologiji, M., 1974.; Spin label method, ur. L. Berliner, prev. s engleskog, M., 1979.; Slobodni radikali u biologiji, ur. W. Prior, prev. s engleskog, svezak 1, str. 88, 178, M., 1979.
K. N. Timofejev.
Iz ESR spektra moguće je odrediti valenciju paramagnetskog iona i simetriju njegove okoline, što u kombinaciji s podacima rendgenske strukturne analize omogućuje određivanje položaja paramagnetskog iona u kristalnoj rešetki. . Vrijednost energetskih razina paramagnetskog iona omogućuje usporedbu EPR rezultata s podacima optičkog spektra i izračunavanje magnetske osjetljivosti paramagnetskih materijala.
EPR metoda omogućuje određivanje prirode i lokalizacije defekata rešetke, kao što su centri boja. U metalima i poluvodičima moguć je i EPR, povezan s promjenom orijentacije spinova elektrona vodljivosti. EPR metoda ima široku primjenu u kemiji i biologiji, gdje u procesu kemijskih reakcija ili pod utjecajem ionizirajućeg zračenja mogu nastati molekule s nepopunjenom kemijskom vezom - slobodni radikali. Njihov g-faktor obično je blizu , a EPR širina linije 
mali Zbog ovih svojstava, jedan od najstabilnijih slobodnih radikala (), s g = 2,0036, koristi se kao standard u EPR mjerenjima. U ER biologiji proučavaju se enzimi, slobodni radikali u biološkim sustavima i organometalni spojevi.
EPR u jakim magnetskim poljima
Ogromna većina eksperimentalnih istraživanja paramagnetske rezonancije provedena je u magnetskim poljima čija je jakost manja od 20 ke. U međuvremenu, korištenje jačih statičkih polja i izmjeničnih polja viših frekvencija značajno bi proširilo mogućnosti EPR metode i povećalo informaciju koju daje. U bliskoj budućnosti postat će dostupna trajna magnetska polja do 250 ke i pulsirajuća polja mjerena u desecima milijuna oersteda. To znači da će Zeemanova cijepanja u konstantnim poljima doseći približno 25 
, au pulsirajućim poljima vrijednosti su dva reda veličine veće. Lowe je koristio spektrometar sa supravodljivim magnetom za mjerenje EPR u poljima H0
65
ke. Prokhorov i njegovi kolege promatrali su EPR signale na valnoj duljini 
=1,21mm.
Jaka magnetska polja trebala bi biti od velike koristi za zračenje iona rijetkih zemalja u kristalima, čiji su intervali između Starkovih podrazina reda veličine 10-100 
. EPR učinak u običnim poljima često izostaje zbog činjenice da se glavna Starkova razina pokaže kao singlet ili zato što su prijelazi između Zeemanovih podrazina glavnog Kramersovog dubleta zabranjeni. Učinak je, općenito govoreći, moguć zbog prijelaza između različitih Starkovih podrazina. Nadalje, kristalno polje u kristalima rijetke zemlje karakterizira veliki broj parametara, za određivanje koje znanje g- tenzor glavnog Kramersovog dubleta nije dovoljan.
Jaka magnetska polja također se mogu koristiti za proučavanje iona željezne skupine, posebno kao što su 
koji imaju podjele reda 10 
100
.
Kada se primijene na razmjeni spregnute parove, jaka magnetska polja omogućit će, promatrajući učinak uzrokovan prijelazima između razina s različitim vrijednostima rezultirajućeg spina S parovi sa spektroskopskom točnošću za mjerenje parametra interakcije izmjene J.
Paramagnetska rezonancija u jakim magnetskim poljima imat će niz značajki. Efekti zasićenja magnetiziranjem dogodit će se pri relativno visokim temperaturama. Pri ne baš niskim temperaturama polarizacija ionskih magnetskih momenata bit će tolika da će osim vanjskog magnetskog polja u uvjete rezonancije biti potrebno unijeti i unutarnje polje. Pojavit će se ovisnost rezonantnih uvjeta o obliku uzorka.
Stečena EPR metoda veliki značaj u kemiji, fizici, biologiji, medicini, jer vam omogućuje određivanje strukture i koncentracije organskih i anorganskih slobodnih radikala. Mogu se stvoriti slobodni radikali kemijska metoda, fotokemijski ili pod utjecajem zračenja visoke energije.
EPR spektar proizvode slobodni radikali, molekule s neparnim brojem elektrona, tripletna stanja organskih molekula, paramagnetski ioni prijelaznih metala i njihovi kompleksi.
Metoda EPR počela se primjenjivati u biološkim istraživanjima 50-ih godina 20. stoljeća. Zbog svoje prilično visoke osjetljivosti i sposobnosti određivanja prirode paramagnetskih čestica, ova metoda je našla široku primjenu za proučavanje niza bioloških procesa.
Osim signala slobodnih radikala, u tkivima se uočava niz signala metala (Fe, Cu, Mn, Ni, Co). Ovi metali su dio metaloproteina, koji sudjeluju u brojnim enzimskim procesima. Proteini koji sadrže željezo (citokromi, feredoksini) sastavni su dijelovi transportnih lanaca elektrona u mitohondrijima i kloroplastima.
EPR metodom proučavan je niz enzimskih sustava i otkriveni su produkti slobodnih radikala supstrata. U nizu slučajeva pokazalo se da je moguće promatrati redoks transformacije metalnih iona uključenih u aktivno središte enzima.
EPR spektroskopija naširoko se koristi u proučavanjima fotosinteze: proučava se mehanizam primarnih faza odvajanja naboja u reakcijskim centrima i daljnji prijenos elektrona duž lanca prijenosa elektrona.
Uz proučavanje mehanizama reakcija koje se odvijaju uz sudjelovanje paramagnetskih čestica, EPR metoda se široko koristi za proučavanje strukturnih i dinamičkih svojstava makromolekula i biomembrana.
Nedavno se metode "paramagnetske sonde", "spin label" i "spin trap" često koriste za proučavanje bioloških i polimernih sustava. Svi se oni temelje na korištenju stabilnih radikala dušične kiseline različitih struktura, točnije na analizi promjena širine linija EPR spektara uzrokovanih rotacijskom i translatornom difuzijom tih radikala.
Glavna ideja metode vrtnje naljepnice i sonde je pričvrstiti na jedno ili drugo funkcionalna skupina protein slobodnih radikala i proučavanje karakteristika njegovih EPR signala. Najprikladniji u tom pogledu su nitroksilni radikali koji sadrže skupinu slobodnih radikala:
gdje su R1 i R2 različite kemijske skupine.
Spin Mark Method sastoji se u činjenici da je stabilni radikal vezan za neparamagnetsku molekulu kovalentnom ili nekom drugom vezom tako da je slobodna valencija nepromijenjena. Priroda kretanja jasno se očituje u obliku spektra i služi kao važan izvor informacija o izvornoj molekuli.
Ako je molekula ugrađena u proteinska molekula i tamo se drži elektrostatskim silama ili hidrofobnim međudjelovanjima, tada se takva molekula naziva spinska sonda. Metoda se temelji na proučavanju rotacijske i translacijske pokretljivosti radikalne sonde u vodenom ili organskom mediju ili u polimernoj matrici. Mobilnost radikala ovisi o pokretljivosti molekula okoliš, dakle, radikal je neka vrsta molekularnog senzora strukturnih i dinamičkih informacija o lokalnom okolišu.
Oblik EPR signala koji proizvodi spinska oznaka ili sonda ovisi o mikrookruženju nitroksidnog radikala i, prije svega, o rotacijskoj pokretljivosti skupine kojoj pripada.
Glavni nedostatak spinskih oznaka i sondi je taj što iako su te molekule male, kada se uključe u lipidni dvosloj donekle mijenjaju njegova svojstva.
Osnova metode "spin zamke" leži u reakciji neparamagnetske molekule (zamke) posebno unesene u sustav koji se proučava s kratkoživućim radikalom, što rezultira stvaranjem stabilnog radikala. Kinetičko ponašanje nastalog stabilnog radikala i njegova struktura daju informacije o kinetici i mehanizmu procesa u sustavu koji se proučava.
Predmeti istraživanja u kemiji pomoću EPR spektroskopije su: 1) slobodni radikali u međuproduktima organskih reakcija; 2) kinetika reakcije; 3) kemija površinskih pojava; 4) razaranja nastala zračenjem; 5) polimerizacija uzrokovana slobodnim radikalima; 6) slobodni radikali zamrznuti na niskim temperaturama; 7) metali promjenljive valencije i njihovi kompleksi.
EPR metoda pruža vrijedan doprinos proučavanju kinetike i mehanizama kemijskih reakcija. Prvo, mjerenje širine linije u EPR spektrima može se koristiti za određivanje konstanti brzine procesa koji uključuju paramagnetske čestice, čije karakteristično vrijeme života leži u rasponu od 10 -5 -10 -10 s. Drugo, EPR metoda omogućuje snimanje s visokom osjetljivošću različitim uvjetima paramagnetskih čestica, što daje vrijedne informacije o mehanizmima reakcije. Treće, EPR spektrometar može se koristiti kao analitički instrument za detekciju koncentracije reagirajućih paramagnetskih molekula tijekom reakcija. Broj paramagnetskih centara u uzorku proporcionalan je površini ispod apsorpcijskog spektra.
EPR metoda naširoko se koristi za proučavanje brzih procesa povezanih s promjenama u molekularnoj strukturi radikala. Ovi procesi uključuju inhibiranu rotaciju i konformacijske prijelaze.
Za kratkoživuće radikale, osjetljivost metode može se povećati korištenjem protočnog sustava ili kontinuiranog zračenja. ESR spektri nestabilnih radikala mogu se dobiti njihovim snimanjem u staklima, smrznutim matricama plemenitih plinova ili kristalima.
Pitanja za intervju
1. Teorijska osnova metoda.
2. Analitički parametri EPR spektra.
3. EPR spektrometri.
4. Primjena EPR-a.
1. Uvjet rezonancije u EPR metodi:
a) n= gH 0 (1-s) / 2p; b) δ = (ΔN/N 0);c) hn=gβH 0; d) δ = (Δν/ν 0)/(ΔN/N 0).
2. Što se događa u trenutku rezonancije u EPR metodi:
a) dolazi do apsorpcije kvanta zračenja, ne dolazi do preorijentacije spina;
b) dolazi do apsorpcije kvanta zračenja i preorijentacije spinova, t.j. prijelaz iz nižeg energetskog stanja u više i obrnuto. Broj prijelaza odozdo prema gore veći je od broja prijelaza odozgo prema dolje.
c) dolazi do apsorpcije kvanta zračenja i preorijentacije spinova, t.j. prijelaz iz nižeg energetskog stanja u više i obrnuto. Broj prijelaza odozgo prema dolje veći je od broja prijelaza odozdo prema gore.
3. Parametri EPR spektra:
a) g-faktor, širina apsorpcijske trake, intenzitet apsorpcijske linije;
b) ukupni broj signala, intenzitet signala, kemijski pomak, višestrukost signala;
c) g-faktor, širina apsorpcijske trake, intenzitet apsorpcijske linije, HFS EPR spektra.
MASENA SPEKROMETRIJA
Ova metoda se bitno razlikuje od spektroskopskih metoda. Metode masene spektrometrije temelje se na ionizaciji tvari, odvajanju iona, prema omjeru ( m/z), i bilježenje mase nastalih fragmenata.
Teorijske i eksperimentalne temelje masene spektrometrije postavio je D.D. Thomson, koji je prvi put 1912. stvorio uređaj za dobivanje masenog spektra pozitivnih iona. Međutim, njegov je instrument imao nisku rezoluciju. Njegov učenik F. Aston 1918. značajno je povećao rezoluciju i prvi put otkrio izotope elemenata pomoću svog instrumenta. Gotovo istovremeno s F. Astonom u Chicagu, A. Dempster konstruirao je prvi maseni spektrometar, u kojemu je transverzalno magnetsko polje služilo kao analizator, a ionske struje su mjerene električnim metodama. Njegov se krug također koristi u modernim uređajima.
Ionizacija molekula mora se provoditi u uvjetima u kojima nastali ion, bez obzira na metodu ionizacije, ne dolazi do sudara s drugim molekulama ili ionima. To je neophodno za uspostavljanje odnosa između svojstava iona i molekule.
Ionizacijske metode
Ionizacija se može provesti različitim metodama.
1. Metoda ionizacije udarom elektrona (EI).
Ovo je najčešća metoda za dobivanje iona zbog jednostavnosti i dostupnosti izvora iona te njihove visoke učinkovitosti. Pretpostavimo da tok elektrona prolazi kroz pare tvari, čija se energija može postupno povećavati. Ako ta energija dosegne određenu razinu, tada kada se elektron sudari s molekulom, elektron može biti "izbačen" iz nje uz stvaranje molekularnog iona:
višeatomna molekula molekularni ion (kation radikala)
Najmanja energija bombardirajućih elektrona pri kojoj dolazi do stvaranja iona iz dane molekule naziva se energija ionizacije tvari. Energija ionizacije je mjera snage kojom molekula drži elektron koji je najmanje vezan za sebe. Za organske molekule energija ionizacije je 9 ÷ 12 eV.
Ako energija elektrona znatno premašuje energiju ionizacije, tada rezultirajući molekularni ion dobiva višak energije, koji može biti dovoljan za prekid veza u njemu. Molekularni ion se raspada na čestice manje mase (fragmente). Ovaj proces se zove fragmentacija . U praksi masene spektrometrije koriste se elektroni s energijom od 30÷100 eV, čime se osigurava fragmentacija molekularnog iona.
Molekularni ioni- to su ioni čije su mase jednake masi ionizirane molekule. Nažalost, ne postoje izravne metode za određivanje strukture iona. Stoga se često koristi pretpostavka o identičnosti strukture molekularnog iona (M +) i neutralne molekule (M). Vjerojatnost stvaranja molekularnog iona veća je za jednostavne, male molekule. Kako se broj atoma u molekuli povećava, povećava se vjerojatnost fragmentacije molekularnog iona.
Poznate su dvije glavne vrste fragmentacije molekularnih iona: disocijacija i preuređivanje.
Disocijacija- raspad molekularnog iona uz zadržavanje slijeda veza. Kao rezultat procesa nastaju kation i radikal:
Disocijacijom ugljikovodika nastaju fragmenti s neparnim m/z omjerima.
Pregrupiranje prati promjena slijeda veza, što rezultira stvaranjem novog kationskog radikala manje mase i neutralne stabilne molekule (H 2 O, CO, CO 2, itd.):
Preraspodjela ugljikovodika i spojeva koji sadržavaju kisik dovodi do fragmenta s ravnomjernim m/z omjerom. Mjerenje mase nastalih fragmenata i njihove relativne količine daje vrijedne informacije o strukturi organskih spojeva.
Razmotrimo uređaj masenog spektrometra (slika 1). Maseni spektrometar mora sadržavati komponente za obavljanje sljedećih funkcija: 1) ionizacija uzorka, 2) ubrzanje iona električnim poljem, 3) raspodjela iona prema omjeru m/z, 4) detekcija iona pomoću odgovarajućeg električni signal.
Sl. 1. Uređaj masenog spektrometra
1 - izvor elektrona; 2 - ionizacijska komora; 3 - ubrzavajuće ploče (negativni potencijal); 4 - magnet; 5 - utor;
6 - sakupljač iona (detektor iona)
Da bi se dobio maseni spektar para tvari male količine pomoću posebnog ulaznog sustava uvode se u ionizacijsku komoru (2) , gdje se održava duboki vakuum (tlak 10 -6 mm Hg). Molekule tvari bombardiraju se strujom elektrona koje emitira vruća katoda (1). Nastali ioni se potiskuju iz ionizacijske komore pomoću male razlike potencijala (3). Rezultirajuća struja iona se ubrzava, fokusira jakim električnim poljem i hvata magnetsko polje (4).
Kao rezultat bombardiranja molekula tvari elektronima, nastaju čestice s pozitivnim ili negativnim nabojem, kao i neutralne čestice. Kada tok čestica prolazi kroz magnetsko polje, neutralne čestice ne mijenjaju smjer, ali se pozitivne i negativne čestice skreću u različitim smjerovima. Količina otklona iona proporcionalna je njihovom naboju i obrnuto proporcionalna njihovoj masi.
Svaki pojedinačni ion, karakteriziran specifičnom vrijednošću m/z, kreće se duž vlastite putanje pri danoj jakosti magnetskog polja. Interval skeniranja mase može se mijenjati mijenjanjem jakosti magnetskog polja ili potencijala električnog polja.
U konvencionalnoj masenoj spektrometriji uobičajeno je registrirati samo čestice koje imaju pozitivan naboj, jer Kada su molekule bombardirane elektronima, obično ima više pozitivno nabijenih iona nego negativno nabijenih. Ako je potrebno proučavati i negativno nabijene ione, treba promijeniti predznak potencijala akceleracije (ploče akceleratora).
Ako je uređaj za snimanje instaliran na izlazu iona iz magnetskog polja, tada će čestice s različitim m/z vrijednostima dati zasebne signale. Intenzitet signala bit će proporcionalan broju čestica s danom vrijednošću m/z. Intenzitet signala je definiran kao njihova visina izražena u mm. Visina vrha s maksimalnim intenzitetom uzima se kao 100% (osnovni vrh), intenzitet preostalih vrhova ponovno se proporcionalno izračunava i izražava kao postotak.
Kako se omjer m/z povećava, razlika u otklonu magnetskim poljem čestica koje se razlikuju za jednu jedinicu atomske mase se smanjuje. U tom pogledu važna karakteristika masenih spektrometra je njihova rezolucija (R) , koji određuje maksimalnu masu iona koji se razlikuju za jednu jedinicu atomske mase (za koju instrument odvaja vrhove za najmanje 90%):
gdje je M najveća masa za koju je preklapanje vrha manje od 10 %; ΔM je jedna jedinica atomske mase.
Standardni uređaji imaju R ≈ 5000/1, a za uređaje s dvostrukim fokusiranjem protoka iona R ≈ 10000/1 i više. Takvi uređaji mogu detektirati razlike u molekularnoj masi iona do 0,0001. Maseni spektrometar s dvostrukim fokusom može lako odvojiti vrhove od iona s istim nominalnim molekulskim težinama, ali različitim elementarnim sastavima. Na primjer, može razlikovati N2 (28,0061), CO (27,9949) i C2H4 (28,0313).
Utvrđivanje empirijske formule iz podataka masenog spektra nije jednostavan zadatak, ali se može riješiti pomoću odgovarajućeg algoritma. Za dobivanje masenog spektra potrebna je zanemariva količina tvari - oko 1 μg.
2. Kemijska ionizacija (CI).
U ovoj metodi, uzorak se razrijedi s velikim viškom "reagens plina" prije ozračivanja snopom elektrona. Vjerojatnost primarnih ionizirajućih sudara između elektrona i molekula uzorka tada je toliko mala da primarni ioni nastaju gotovo isključivo iz molekula reaktanata. Kao reagensi obično se koriste plinovi male molekularne težine, npr. CH 4, izo-C 4 H 10, NH 3 i inertni plinovi (Ar, He). Sekundarni ioni nastaju prijenosom atoma vodika ili elektrona.
Ako je metan plin reagens, tada se reakcije odvijaju sljedećim redoslijedom:
CH 4 + ē → CH 4 + + 2ē
CH 4 + + ē → CH 3 + +H + + 2ē
CH 4 + + CH 4 → CH 5 + + CH 3
CH 3 + + CH 4 → C 2 H 5 + +H2
R-CH3 + CH5 + → R-CH 4 + + CH 4
gdje je R-CH 3 molekula ispitivane tvari.
Istraživanja su pokazala da čestice CH 5 + i C2H5 + zajedno čine oko 90% iona prisutnih u ovom sustavu. Maseni spektri dobiveni nakon kemijske ionizacije puno su jednostavniji, sadrže manje vrhova i stoga ih je često lakše interpretirati.
Elektronska paramagnetska rezonancija (EPR) je pojava rezonantne apsorpcije elektromagnetskog zračenja od strane paramagnetske tvari koja se nalazi u konstantnom magnetskom polju. Uzrokovan kvantnim prijelazima između magnetskih podrazina paramagnetskih atoma i iona (Zeemanov efekt). ESR spektri promatraju se uglavnom u ultravisokom frekvencijskom (mikrovalnom) području.
Metoda elektronske paramagnetske rezonancije omogućuje procjenu učinaka koji se pojavljuju u EPR spektrima zbog prisutnosti lokalnih magnetskih polja. Zauzvrat, lokalna magnetska polja odražavaju sliku magnetskih interakcija u sustavu koji se proučava. Dakle, metoda EPR spektroskopije omogućuje proučavanje i strukture paramagnetskih čestica i interakcije paramagnetskih čestica s okolinom.
EPR spektrometar namijenjen je snimanju spektara i mjerenju parametara spektra uzoraka paramagnetskih tvari u tekućoj, krutoj ili praškastoj fazi. Koristi se u implementaciji postojećih i razvoju novih metoda za proučavanje tvari EPR metodom u raznim područjima znanosti, tehnologije i zdravstva: na primjer, za proučavanje funkcionalnih karakteristika bioloških tekućina na temelju spektra spinskih sondi uvedenih u njih u medicini; detektirati radikale i odrediti njihovu koncentraciju; u proučavanju intramolekularne pokretljivosti u materijalima; u poljoprivredi; u geologiji.
Osnovni uređaj analizatora je spektrometrijska jedinica - spektrometar elektronske paramagnetske rezonancije (EPR spektrometar).
Analizator pruža mogućnost proučavanja uzoraka:
- s regulatorima temperature - sustavi za kontrolu temperature uzorka (uključujući temperaturni raspon od -188 do +50 ºS i na temperaturi tekućeg dušika);
- u kivetama, ampulama, kapilarama i epruvetama pomoću sustava za automatsku izmjenu uzoraka i doziranje.
Značajke EPR spektrometra
Paramagnetski uzorak u posebnoj ćeliji (ampuli ili kapilari) nalazi se unutar radnog rezonatora smještenog između polova elektromagneta spektrometra. U rezonator ulazi elektromagnetsko mikrovalno zračenje konstantne frekvencije. Stanje rezonancije postiže se linearnom promjenom jakosti magnetskog polja. Za povećanje osjetljivosti i rezolucije analizatora koristi se visokofrekventna modulacija magnetskog polja.
Kada indukcija magnetskog polja dosegne vrijednost karakterističnu za dati uzorak, dolazi do rezonantne apsorpcije energije tih vibracija. Pretvoreno zračenje tada ulazi u detektor. Nakon detekcije, signal se obrađuje i šalje u uređaj za snimanje. Visokofrekventna modulacija i fazno osjetljiva detekcija pretvaraju EPR signal u prvu derivaciju apsorpcijske krivulje, u obliku koje se snimaju spektri elektronske paramagnetske rezonancije. Pod tim uvjetima također se bilježi integralna EPR apsorpcijska linija. Primjer snimljenog rezonantnog apsorpcijskog spektra prikazan je na donjoj slici.
