Application de la méthode de résonance paramagnétique électronique à l'étude des huiles et matières organiques diffusées. Résonance paramagnétique électronique. Méthode RPE. Applications Résonance électronique

REP

Principe de la méthode EPR

L'histoire de la découverte de la méthode EPR

Méthode RPE est la principale méthode d'étude des particules paramagnétiques présentes dans les systèmes biologiques. Les particules paramagnétiques d'une grande importance biologique comprennent deux principaux types de composés - ce sontradicaux libres et métaux à valence variable (tel que Fe, Cu, Co, Ni, Mn) ou leurs complexes. En plus des états de radicaux libres, la méthode EPR est utilisée pour étudier les états triplets qui apparaissent au cours des processus photobiologiques.

La méthode de résonance paramagnétique électronique a été découverte relativement récemment - en 1944 . à l'Université de Kazan par Evgeny Konstantinovich ZAVOYSKY dans l'étude de l'absorption de l'énergie électromagnétique par les sels métalliques paramagnétiques. Il a remarqué qu'un seul cristal CuCl 2, placé dans un champ magnétique constant de 40 Gauss (4 mT) commence à absorber le rayonnement micro-onde avec une fréquence d'environ 133 MHz.

Les pionniers de l'utilisation de l'EPR dans la recherche biologique en URSS étaient L.A. Blumenfeld et A.E. Kalmanson, qui publie un article en 1958 dans la revue Biophysics sur l'étude des radicaux libres produits par l'action des rayonnements ionisants sur les protéines.

Moments mécaniques et magnétiques d'un électron

Le mouvement orbital et de spin des électrons sous-tend leurs moments mécaniques orbitaux et de spin. Moment cinétique orbital d'un électron R le long d'une orbite de rayon R équivaut à:

Où je est le courant dans le circuit, et S - l'aire du contour (dans ce cas, l'orbite circulaire est égale à pR2 ). En remplaçant dans la formule (2) l'expression de l'aire et en tenant compte du fait que :

En comparant les expressions des moments mécaniques et magnétiques de l'électron (1) et (4), on peut écrire que :

Où n - nombre quantique orbital, qui prend les valeurs 0, 1, 2 et m Dans ce cas, en tenant compte de (6), l'expression du moment magnétique orbital ressemblera à :

Le moment magnétique de spin d'un électron est associé au mouvement de spin d'un électron, qui peut être représenté comme un mouvement autour de son propre axe. Le moment mécanique de spin d'un électron est égal à :

Où S - nombre quantique de spin égal à 1/2 .

Les moments de spin magnétique et mécanique sont liés par la relation :

(10)

Où MME - nombre quantique magnétique, égal à +1/2 . Le rapport du moment magnétique au moment mécanique est appelé le rapport gyromagnétique ( g ). On peut voir que pour le mouvement orbital : , et pour le spin : Pour le rapport gyromagnétique des électrons avec différentes contributions de mouvement orbital et de spin, le coefficient de proportionnalité est introduit g , tel que:

(11)

Ce facteur de proportionnalité est appelé g -facteur. g =1, à S =0, c'est-à-dire lorsqu'il n'y a pas de mouvement de rotation de l'électron et qu'il n'y a qu'un mouvement orbital, et g =2 s'il n'y a pas de mouvement orbital et qu'il n'y a qu'un mouvement de spin (par exemple, pour un électron libre).

Le moment magnétique d'un électron est généralement composé derotation et orbiteinstants magnétiques. Cependant, dans la plupart des cas, le moment magnétique orbital est nul. Par conséquent, lors de la discussion du principe de la méthode ýïr, seulsmoment magnétique de spin.

Effet Zeeman

L'énergie d'interaction du moment magnétique d'un électron avec un champ magnétique s'exprime par l'équation :

(12)

Où m H - intensité du champ magnétique, cos( mH ) est le cosinus de l'angle entre m et H .

Effet Zeeman (Fig. 1) ( ES =+1/2 et ES =-1/2 )

De l'équation (11), il s'ensuit que :

Dans ce cas, la différence d'énergie entre les deux niveaux sera :

(15)

L'équation (14) décrit l'effet Zeeman, qui peut être exprimé dans les mots suivants :les niveaux d'énergie des électrons placés dans un champ magnétique sont répartis dans ce champ en fonction de l'amplitude du moment magnétique de spin et de l'intensité du champ magnétique.

Équation de résonance de base

Le nombre d'électrons ayant une énergie particulière sera déterminé conformément à la distribution de Boltzmann, à savoir :

Si maintenant une énergie électromagnétique est appliquée à un système d'électrons dans un champ magnétique, alors à certaines valeurs de l'énergie du quantum incident, des transitions d'électrons entre les niveaux se produiront. Une condition nécessaire pour les transitions est l'égalité de l'énergie du quantum incident ( hn ) différence d'énergie entre les niveaux d'électrons de spins différents ( gbH ).

(17)

L'équation (17) exprime la condition principale de l'absorption d'énergie par les électrons. Sous l'influence du rayonnement, les électrons qui sont à un niveau d'énergie supérieur vont émettre de l'énergie et revenir à un niveau inférieur, ce phénomène est appeléémission induite.

Les électrons au niveau inférieur vont absorber de l'énergie et passer à un niveau d'énergie supérieur, ce phénomène est appeléabsorption résonnante. Étant donné que les probabilités de transitions simples entre les niveaux d'énergie sont égales et que la probabilité de transition totale est proportionnelle au nombre d'électrons dans un niveau d'énergie donné, alorsl'absorption d'énergie prévaudra sur son émission . Cela est dû au fait que, comme il ressort de l'équation (16), la population du niveau inférieur est supérieure à la population du niveau d'énergie supérieur.

À ce stade, il convient de noter la position particulière des radicaux libres, c'est-à-dire molécules avec des électrons non appariés dans l'orbitale électronique externe dans la distribution des électrons sur les niveaux d'énergie. Si l'orbitale a une paire d'électrons, alors naturellement, la population des niveaux d'énergie sera la même et la quantité d'énergie absorbée par les électrons sera égale à la quantité d'énergie émise.

L'absorption d'énergie par une substance placée dans un champ magnétique ne sera perceptible que s'il n'y a qu'un seul électron dans l'orbite, alors on pourra parler deRépartition de Boltzmannélectrons entre les niveaux d'énergie.

Caractéristiques des spectres RPE

Amplitude du signal

Pour déterminer la concentration, les aires sous la courbe d'absorption sont mesurées pour un standard avec une concentration connue de centres paramagnétiques dans l'échantillon mesuré et une concentration inconnue; se trouve à partir de la proportion, à condition que les deux échantillons aient la même forme et le même volume :

(18)

Où C tour. et C cette. - concentration échantillon mesuré et standard, respectivement, et S tour. et S cette. - Région sous les raies d'absorption du signal mesuré et de l'étalon.

Pour déterminer l'aire sous la raie d'absorption d'un signal inconnu, vous pouvez utiliser la méthode d'intégration numérique :

Où f(H) - dérivée premièreraies d'absorption (spectre RPE), F(H) - fonction raies d'absorption, et H - tension champ magnétique.

Où f"(H) est la dérivée première de la raie d'absorption, ou Spectre RPE . Il est facile de passer de l'intégrale à la somme intercalaire, étant donné que H=n*DH , on a:

(21)

Où D.H. est l'étape de modification du champ magnétique, et n i - numéro d'étape.

Ainsi, l'aire sous la courbe d'absorption sera égale au produit du carré du pas de champ magnétique et de la somme des produits de l'amplitude du spectre RPE et du nombre de pas. D'après l'expression (21), il est facile de voir que pour de grandes n (c'est-à-dire loin du centre du signal) la contribution des parties éloignées du spectre peut être assez importante même à de petites valeurs de l'amplitude du signal.

Forme de ligne

Bien que, selon l'équation de résonance de base, l'absorption ne se produise que lorsque l'énergie du quantum incident est égale à la différence d'énergie entre les niveaux d'électrons non appariés, le spectre EPR n'est pas une ligne, mais continu dans un voisinage du point de résonance. La fonction décrivant le signal EPR est appeléefonction de forme de ligne . Dans les solutions diluées, lorsque l'interaction entre particules paramagnétiques peut être négligée, la courbe d'absorption est décrite par la fonction de Lorentz :

La fonction gaussienne est enveloppe Spectre RPE s'il y a interaction entre particules paramagnétiques. Il est particulièrement important de considérer la forme de la ligne lors de la détermination de l'aire sous la courbe d'absorption. Comme on peut le voir à partir des formules (22) et (23), la fonction de Lorentz a une décroissance plus lente et, par conséquent, des ailes plus larges, ce qui peut donner une erreur significative lors de l'intégration du spectre.

Largeur de ligne

La largeur du spectre RPE dépend de l'interaction du moment magnétique de l'électron avec les moments magnétiques des noyaux environnants(réseau) et des électrons.

Considérons plus en détail le mécanisme d'absorption d'énergie par des électrons non appariés. Si dans l'état de basse énergie il y a N 1 électrons, et à haute énergie N 2 et N 1 de plus N 2, puis lorsque l'énergie électromagnétique est appliquée à l'échantillon, la différence entre les populations de niveau diminuera jusqu'à ce qu'elle devienne égale à zéro.

En effet, les probabilités d'une seule transition sous l'action d'un rayonnement d'un état de basse énergie à un état de haute énergie et vice versa ( O 12 et O 21) sont égaux entre eux, et la population du niveau inférieur est plus élevée. Introduisons une variable n =N 1 -N 2. Alors l'évolution de la différence des populations de niveau au cours du temps peut s'écrire :

et ; où

(24)

Cependant, dans l'expérience, aucun changement dans la différence de population de niveau n'est observé en raison du fait qu'il existe des processus de relaxation qui maintiennent cette différence constante. Le mécanisme de relaxation consiste à transférer un quantum d'énergie électromagnétique au réseau ou aux électrons environnants et à ramener l'électron à un niveau de basse énergie

Si nous désignons les probabilités des transitions induites par le réseau comme P 12 et P 21 , et P 12 de moins P 21 , alors la variation de la différence de niveau de population sera :

À l'état stationnaire, lorsque la variation de la différence de population est nulle, la différence initiale entre les populations de niveau ( n 0) reste constant et égal à :

Ou remplacer P 12 +P 21 le 1/T 1 , on obtient

(29)

Évaluer J 1 appelétemps de relaxation spin-réseauet caractérise la durée de vie moyenne de l'état de spin. En conséquence, la variation de la différence de population entre les niveaux du système d'électrons non appariés, qui est sous l'influence du rayonnement électromagnétique et interagit avec le réseau, sera déterminée par l'équation :

Et à 2WT 1 beaucoup moins 1 , n = n 0 , c'est-à-dire à des puissances relativement faibles, la différence de niveau de population reste pratiquement constant . De la relation d'incertitude de Heisenberg, il résulte que :

(32)

Si nous acceptons que Dt équivaut à J 1 , et DE correspond gbDH , alors l'équation (32) peut être réécrite comme suit :

(33)

Ceux. l'incertitude sur la largeur de raie est inversement proportionnelle au temps de relaxation spin-réseau.

En plus de l'interaction du moment magnétique d'un électron non apparié avec le réseau, son interaction avec les moments magnétiques d'autres électrons est également possible. Cette interaction conduit à une diminution du temps de relaxation et donc à un élargissement de la raie dans le spectre RPE. Dans ce cas, le concept de temps de relaxation spin-spin est introduit ( J 2). Le temps de relaxation observé est considéré comme la somme des temps de relaxation spin-réseau et spin-spin.

Pour les radicaux libres dans les solutions J 1 beaucoup moins J 2 , donc la largeur de la ligne sera déterminée par J 2. Parmi les mécanismes d'élargissement de ligne, il convient de mentionner :interaction dipôle-dipôle ; anisotropie du facteur g ; élargissement de ligne dynamique et échange de spin .

L'interaction dipôle-dipôle est basée sur l'interaction du moment magnétique d'un électron non apparié avec le champ magnétique local créé par les électrons et les noyaux voisins. La force du champ magnétique en tout point dépend de la distance à ce point et de l'orientation mutuelle des moments magnétiques d'un électron non apparié et d'un autre électron ou noyau en interaction. La variation de l'énergie d'un électron non apparié sera déterminée par :

(34)

Où m est le moment magnétique de l'électron, R - distance à la source du champ magnétique local, q est l'angle entre les moments magnétiques en interaction.

Contribution à l'anisotropie g -le facteur d'élargissement de la raie EPR est dû au fait que le mouvement orbital d'un électron crée un champ magnétique alternatif avec lequel le moment magnétique de spin interagit. Cette interaction entraîne une déviation g -facteur de valeur 2,0023 correspondantélectron libre.

Pour les échantillons cristallins, les valeurs g -facteur correspondant à l'orientation du cristal désigne g xx, g aa et g zz respectivement. Lorsque les molécules se déplacent rapidement, par exemple dans les solutions, l'anisotropie g -facteur peut être moyenné.

L'élargissement du signal EPR peut être dû à la transformation mutuelle des deux formes du radical. Ainsi, si chacune des formes du radical a son propre spectre EPR, alors une augmentation du taux de transformation mutuelle de ces formes les unes dans les autres conduira à un élargissement des raies, puisque dans ce cas, la durée de vie du radical dans chaque état diminue. Ce changement de largeur de signal est appeléélargissement dynamique du signal. L'échange de spin est un autre moyen d'élargir le signal EPR. Le mécanisme d'élargissement du signal lors d'un échange de spin consiste à changer la direction du moment magnétique de spin d'un électron dans le sens opposé lorsqu'il entre en collision avec un autre électron non apparié ou un autre paramagnétique.

Puisqu'une telle collision réduit la durée de vie d'un électron dans un état donné, le signal EPR est élargi. Le cas le plus fréquent d'élargissement de la raie RPE par le mécanisme d'échange de spin est l'élargissement du signal en présence d'oxygène ou d'ions métalliques paramagnétiques.

Structure hyperfine

Le dédoublement de la raie EPR en plusieurs repose sur le phénomène d'interaction hyperfine, c'est-à-dire l'interaction des moments magnétiques des électrons non appariés ( M S) avec les moments magnétiques des noyaux ( M N).

Puisqu'en présence du moment magnétique du noyau, le moment magnétique total est égal à M S+ M N, où M S est le moment magnétique de l'électron, et M N est le moment magnétique du noyau, puis le champ magnétique total H les montants. = H 0 ± H ok. , où H ok. - champ magnétique local créé par le moment magnétique du noyau. Dans ce cas, au lieu d'une valeur de champ résonant, il y aura deux - H 0 + H ok. et H 0 - H ok. , qui correspondra à deux lignes. Ainsi, au lieu d'une ligne à H 0 nous obtenons deux lignes à H 0 + H ok. et H 0 - H ok. .

Une caractéristique importante de l'interaction hyperfine est les règles de sélection pour les transitions entre les niveaux. Les transitions autorisées sont des transitions dans lesquelles le changement du moment magnétique de spin d'un électron non apparié ( DM S) est égal 1 , et le moment magnétique de spin du noyau ( DM N) est égal à 0 .

Dans l'exemple que nous avons considéré, le spin du noyau interagissant avec l'électron non apparié était un demi-entier et était égal à ± 1/2, ce qui nous a finalement divisé en deux lignes. Cette rotation est typique pour protons . Au noyau des atomes d'azote ( N 14) spin entier. Il peut prendre des valeurs ±1 et 0 . Dans ce cas, lorsque l'électron non apparié interagit avec le noyau de l'atome d'azote, une division en trois lignes identiques sera observée, correspondant à la valeur de spin +1 , -1 et 0 . Dans le cas général, le nombre de raies dans le spectre EPR est égal à 2M N+ 1 .

Naturellement, le nombre d'électrons non appariés et, par conséquent, l'aire sous la courbe d'absorption EPR ne dépendent pas de l'amplitude du spin nucléaire et sont des valeurs constantes. Par conséquent, lors de la division d'un seul signal EPR en deux ou trois, l'intensité de chaque composante sera, respectivement, en 2 ou 3 fois plus bas.

Une image très similaire se produit si un électron non apparié interagit non pas avec un, mais avec plusieurs noyaux équivalents (avec la même constante d'interaction hyperfine) qui ont un moment magnétique différent de zéro, par exemple deux protons. Dans ce cas, trois états apparaissent correspondant à l'orientation des spins du proton :

1. à la fois sur le terrain,

2. les deux contre le terrain

3. un sur le terrain et un contre le terrain.

Option 3 est deux fois plus probable que 1 ou 2 , car peut se faire de deux manières. À la suite d'une telle distribution d'électrons non appariés, une seule ligne se divise en trois lignes avec le rapport d'intensité 1:2:1 . En général, pour n noyaux équivalents de spin M N nombre de lignes est 2nM N+ 1 .

Appareil de spectromètre radio EPR

Le dispositif du spectromètre radio EPR ressemble à bien des égards au dispositif d'un spectrophotomètre pour mesurer l'absorption optique dans les parties visible et ultraviolette du spectre.

La source de rayonnement dans le spectromètre radio est le klystron, qui est une lampe radio qui émet un rayonnement monochromatique dans la gamme des ondes centimétriques. L'ouverture du spectrophotomètre dans le radiospectromètre correspond à un atténuateur qui permet de doser la puissance incidente sur l'échantillon. La cuvette avec l'échantillon dans le spectromètre radio est située dans une unité spéciale appelée le résonateur. Le résonateur est un parallélépipède à cavité cylindrique ou rectangulaire dans laquelle se trouve un échantillon absorbant. Les dimensions du résonateur sont telles qu'une onde stationnaire s'y forme. L'élément manquant dans le spectromètre optique est un électroaimant qui crée un champ magnétique constant nécessaire pour diviser les niveaux d'énergie des électrons.

Le rayonnement qui a traversé l'échantillon mesuré, dans le spectromètre radio et dans le spectrophotomètre, frappe le détecteur, puis le signal du détecteur est amplifié et enregistré sur un enregistreur ou un ordinateur. Une autre différence du radiospectromètre doit être notée. Elle réside dans le fait que le rayonnement de la gamme radio est transmis de la source à l'échantillon puis au détecteur à l'aide de tubes rectangulaires spéciaux appelés guides d'ondes. Les dimensions de la section transversale des guides d'ondes sont déterminées par la longueur d'onde du rayonnement transmis. Cette caractéristique de la transmission de l'émission radio à travers des guides d'ondes détermine le fait qu'une fréquence constante de rayonnement est utilisée pour enregistrer le spectre EPR dans le spectromètre radio, et la condition de résonance est obtenue en modifiant l'amplitude du champ magnétique.

Une autre caractéristique importante du spectromètre radio est l'amplification du signal au moyen de sa modulation par un champ alternatif à haute fréquence. En raison de la modulation du signal, il est différencié et la raie d'absorption est convertie en sa première dérivée, qui est le signal EPR.

Signaux RPE observés dans les systèmes biologiques

L'utilisation de la méthode EPR dans la recherche biologique est associée à l'étude de deux principaux types de centres paramagnétiques - les radicaux libres et les ions métalliques de valence variable. L'étude des radicaux libres dans les systèmes biologiques est associée à une difficulté qui consiste dans la faible concentration de radicaux libres formés lors de l'activité vitale des cellules. La concentration de radicaux dans les cellules métabolisant normalement est, selon diverses sources, d'environ 10 -8 - 10 -10M , tandis que les radiospectromètres modernes permettent de mesurer les concentrations de radicaux 10 -6 - 10 -7M.

Vous pouvez augmenter la concentration de radicaux libres en ralentissant leur mort et en augmentant le taux de leur formation. Cela peut être fait en irradiant (UV ou rayonnement ionisant) des objets biologiques à basse température.

L'étude de la structure des radicaux de molécules biologiquement importantes plus ou moins complexes a été l'un des premiers domaines d'application de la méthode RPE dans la recherche biologique.

Spectres RPE de la cystéine irradiée aux UV

Spectre RPE du foie de rat

Un autre domaine d'application important de la méthode EPR dans la recherche biologique était l'étude des métaux de valence variable et/ou de leurs complexes qui existentin vivo.

Si vous regardez le spectre EPR, par exemple, d'un foie de rat, vous pouvez voir les signaux du cytochrome R-450 ayant g -facteur 1,94 et 2,25 , signal de méthémoglobine avec g -facteur 4,3 et un signal de radical libre appartenant aux radicaux semiquinones de l'acide ascorbique et des flavines avec g -facteur 2,00 .

En raison des temps de relaxation courts, les signaux EPR des métalloprotéines ne peuvent être observés qu'à basse température, comme l'azote liquide.

Cependant, les signaux EPR de certains radicaux peuvent également être observés à température ambiante. Ces signaux comprennent les signaux EPR de nombreux radicaux semiquinone ou phénoxyle, tels que le radical semiquinone de l'ubiquinone, le radical phénoxy et semiquinone de l'a-tocophérol (vitamine E), vitamine A ré, et plein d'autres.

RÉSONANCE PARAMAGNETIQUE ÉLECTRONIQUE (RPE)- absorption résonnante des ondes électromagnétiques par des substances contenant des particules paramagnétiques. Les méthodes basées sur la RPE ont trouvé une large application dans la pratique de laboratoire. Avec leur aide, ils étudient la cinétique des réactions chimiques et biochimiques (voir Cinétique des processus biologiques, Cinétique chimique), le rôle des radicaux libres dans les processus vitaux de l'organisme en conditions normales et pathologiques (voir Radicaux libres), les mécanismes de occurrence et flux de processus photobiologiques (voir Photobiologie) etc.

Le phénomène EPR a été découvert par le scientifique soviétique B.K. Zavoisky en 1944. La résonance paramagnétique électronique n'est caractéristique que des particules paramagnétiques, c'est-à-dire des particules capables d'être magnétisées lorsqu'un champ magnétique leur est appliqué) avec un moment magnétique électronique non compensé, qui, à son tour, est dû au moment mécanique de l'électron - le spin. Les électrons ont un type particulier de mouvement interne, qui peut être comparé à la rotation d'une toupie autour de son axe. Le moment cinétique associé est appelé spin. En raison du spin, l'électron a un moment magnétique permanent dirigé à l'opposé du spin. Dans la plupart des molécules, les électrons sont disposés en orbitales de telle manière que leurs spins sont dirigés de manière opposée, les moments magnétiques sont compensés et le signal EPR émis par eux ne peut pas être observé. Si le champ magnétique d'un électron n'est pas compensé par le spin d'un autre électron (c'est-à-dire que la molécule contient des électrons non appariés), un signal EPR est alors enregistré. Les particules avec des électrons non appariés sont des radicaux libres, des ions de nombreux métaux (fer, cuivre, manganèse, cobalt, nickel, etc.), un certain nombre d'atomes libres (hydrogène, azote, métaux alcalins, etc.).

En l'absence de champ magnétique externe, la direction (orientation) du moment magnétique d'un électron dans l'espace peut être quelconque ; l'énergie d'un tel électron ne dépend pas de l'orientation de son moment magnétique. Conformément aux lois de la mécanique quantique, dans un champ magnétique externe, l'orientation du moment magnétique d'un électron ne peut être arbitraire - elle peut être dirigée soit dans la direction du champ magnétique, soit à l'opposé de celle-ci.

Conformément à l'orientation du moment magnétique d'un électron, son énergie dans un champ magnétique ne peut également prendre que deux valeurs : le minimum E1 - lorsque le moment magnétique est orienté "le long du champ" et le maximum E2 - lorsqu'il est orienté "à contre-champ" et la différence des énergies de ces états (delta E ) est calculée par la formule : ΔE = gβH, où β est le magnéton de Bohr (unité de mesure du moment magnétique d'un électron), H est l'intensité du champ magnétique, g est une constante dépendant de la structure électronique de la particule paramagnétique. Si un système d'électrons non appariés dans un champ magnétique externe est affecté par un rayonnement électromagnétique dont l'énergie quantique est égale à ΔE, alors sous l'influence du rayonnement, les électrons commenceront à passer d'un état avec une énergie inférieure à un état avec une énergie plus élevée, qui s'accompagnera de l'absorption du rayonnement par la substance.

La RPE est appelée méthodes de spectroscopie radio, car le rayonnement dans la gamme de fréquences radio des ondes électromagnétiques est utilisé pour observer la résonance paramagnétique électronique.

L'EPR est enregistrée à l'aide d'instruments spéciaux - des spectromètres radio. Ils comprennent : un électroaimant, une source de rayonnement radiofréquence, une ligne de transmission de rayonnement de la source à l'échantillon (guide d'onde), un résonateur dans lequel se trouve l'échantillon à étudier, des systèmes de détection, d'amplification et d'enregistrement du signal. Les spectromètres radio les plus courants qui utilisent un rayonnement électromagnétique avec des longueurs d'onde de 3,2 cm ou 8 mm.

L'enregistrement du signal EPR est effectué comme suit. L'intensité du champ magnétique créé par l'électroaimant change linéairement dans certaines limites. Aux valeurs de tension correspondant à la condition de résonance, l'échantillon absorbe l'énergie du rayonnement électromagnétique. La raie d'absorption (signal EPR) est la dépendance de la puissance de rayonnement absorbée par l'échantillon à l'intensité du champ magnétique. Dans les spectromètres radio existants, le signal EPR est enregistré comme la dérivée première de la raie d'absorption.

Pour décrire et analyser les spectres RPE, un certain nombre de paramètres caractérisant l'intensité des raies, leur largeur, leur forme et leur position dans le champ magnétique sont utilisés. L'intensité des raies RPE, toutes choses égales par ailleurs, est proportionnelle à la concentration en particules paramagnétiques, ce qui permet d'effectuer une analyse quantitative.

Lorsque l'on considère le phénomène EPR, il faut tenir compte du fait que le moment magnétique d'un électron non apparié interagit non seulement avec le champ magnétique d'un électroaimant, mais également avec les champs magnétiques créés par l'environnement de l'électron : autres électrons non appariés, noyaux magnétiques (voir résonance magnétique nucléaire). L'interaction des électrons non appariés avec les noyaux conduit souvent à la division du spectre RPE en un certain nombre de raies. L'analyse de tels spectres permet d'identifier la nature des particules paramagnétiques et d'évaluer la nature et le degré de leur interaction entre elles.

La participation des particules paramagnétiques aux réactions chimiques, au mouvement moléculaire et à d'autres effets cinétiques affecte également la forme du spectre RPE. Par conséquent, la RPE est utilisée pour détecter, quantifier et identifier les particules paramagnétiques, étudier la cinétique des réactions chimiques et biochimiques et la dynamique moléculaire.

En raison de sa polyvalence, l'EPR est largement utilisé dans divers domaines scientifiques. L'utilisation de l'EPR en biologie et en médecine est due à sa présence dans les cellules, les tissus et le biol. liquides de divers centres paramagnétiques dans la nature. Avec l'aide de l'EPR, la présence de radicaux libres a été trouvée dans presque tous les tissus animaux et végétaux. La source de radicaux libres sont des composés tels que les flavines, la coenzyme Q et d'autres substances qui agissent comme transporteurs d'électrons dans les réactions du métabolisme énergétique dans les cellules végétales et animales ; les centres paramagnétiques présents dans les tissus isolés appartiennent principalement aux chaînes de transport d'électrons des mitochondries, des microsomes, des chloroplastes (voir Respiration). Il a été constaté que la teneur en radicaux libres dans les tissus est en corrélation avec leur activité métabolique. De nombreux travaux montrent une modification du nombre de radicaux libres dans diverses conditions pathologiques, par exemple au cours de l'oncogenèse (voir), le développement de dommages causés par les radiations (voir), la toxicose (voir Intoxication), qui s'explique par une violation du métabolisme énergétique dans pathologie (voir Bioénergétique).

À l'aide de la RPE dans les tissus des animaux et des plantes, les ions paramagnétiques (fer, cuivre, manganèse, cobalt, etc.) sont déterminés, qui font partie des métalloprotéines impliquées dans les réactions de transfert d'électrons le long des chaînes de transport d'électrons et la catalyse enzymatique, ainsi que comme dans les pigments porteurs d'oxygène (hémoglobine). Grâce à la RPE, il est possible d'étudier les transformations redox des ions métalliques et la nature de l'interaction des ions avec leur environnement, ce qui permet d'établir la structure fine des complexes contenant des métaux.

Les modifications pathologiques des tissus entraînent des modifications des signaux EPR des métalloprotéines, qui sont associées à la désintégration des complexes métalliques paramagnétiques, aux modifications de l'environnement des ions paramagnétiques et à la transition des ions vers d'autres complexes. Cependant, l'étude de la nature des centres paramagnétiques des tissus, notamment des radicaux libres, est associée à certaines difficultés dues à la complexité du déchiffrement des spectres RPE.

Avec l'aide de l'EPR, il a été possible d'étudier les mécanismes des réactions enzymatiques (voir Enzymes). En particulier, il est possible d'étudier simultanément à la fois la cinétique de formation et de consommation des radicaux libres lors des réactions enzymatiques et la cinétique des transformations redox des métaux faisant partie des enzymes, ce qui permet d'établir l'enchaînement des étapes d'une réaction enzymatique. réaction.

L'utilisation de l'EPR dans l'étude des radiolésions en biol. permet d'obtenir des informations sur la nature des radicaux formés dans les biopolymères, sur les mécanismes et la cinétique des réactions radicalaires qui se développent dans les objets irradiés et conduisent à un effet biologique. La méthode EPR peut être utilisée en dosimétrie d'urgence, par exemple, en cas d'exposition accidentelle de personnes pour évaluer la dose d'exposition, en utilisant pour cela des objets de la zone d'exposition.

Une place importante est occupée par la RPE dans l'étude des processus photobiologiques impliquant les radicaux libres (voir Molécule, Radicaux libres, Photobiologie, Photosensibilisation). La RPE permet d'étudier en détail la formation de radicaux libres dans les protéines, les acides nucléiques et leurs composants sous l'action du rayonnement ultraviolet, et le rôle de ces radicaux dans la photodégradation des biopolymères (voir Lumière). L'utilisation de l'EPR a donné des informations importantes sur les mécanismes primaires de la photosynthèse (voir). Il a été montré que la réaction primaire de la photosynthèse est le transfert d'un électron d'une molécule de chlorophylle excitée par la lumière et la formation d'un cation radicalaire de la chlorophylle. La nature des molécules qui acceptent un électron donné par une molécule de chlorophylle excitée a également été identifiée.

La RPE est également utilisée pour étudier la structure de macromolécules et de biomembranes biologiquement importantes. Par exemple, les ions de fer qui font partie de l'hème dans les protéines contenant de l'hème peuvent être dans un état de spin élevé (les électrons des orbites externes ne sont pas appariés, le spin total est maximal) et de spin faible (les électrons externes sont entièrement ou partiellement appariés , le spin est minime). Des études des caractéristiques des signaux EPR des états de spin élevé et bas des ions de fer dans l'hémoglobine et ses dérivés ont contribué à comprendre la structure spatiale de la molécule d'hémoglobine.

Des avancées significatives dans l'étude de la structure des biomembranes et des biopolymères ont été réalisées après l'avènement des méthodes de sonde de spin et de marquage (voir Membranes biologiques ). Comme marqueurs de spin et sondes, les radicaux nitroxydes stables sont principalement utilisés (voir Radicaux libres). Le radical nitroxyle peut être lié de manière covalente à des molécules (marqueur de spin) ou retenu dans le système étudié en raison d'interactions physiques (sonde de spin). L'essentiel réside dans le fait que la forme du spectre EPR des radicaux nitroxyde dépend des propriétés du microenvironnement : viscosité, nature et mouvement moléculaire, champs magnétiques locaux, etc. Les spin-marks liés de manière covalente à divers groupes de biopolymères sont un indicateur de l'état de la structure du biopolymère. À l'aide de marqueurs de spin, la structure spatiale des biopolymères, les changements structurels des protéines lors de la dénaturation, la formation de complexes enzyme-substrat, antigène-anticorps, etc., sont étudiés.

La méthode des sondes de spin est utilisée pour étudier les modes de compactage et de mobilité des lipides dans les biomembranes, les interactions lipides-protéines, les transitions structurelles dans les membranes causées par l'action de diverses substances, etc. Basées sur l'étude de marqueurs de spin et de sondes, des méthodes de dosage de médicaments dans le biol. liquides, ainsi que les problèmes de transport dirigé de médicaments, etc.

Ainsi, avec l'aide de l'EPR, une large distribution des processus électroniques dans le corps est montrée dans la norme et en cas de pathologie. La création de la théorie et l'amélioration de la technologie de la méthode EPR ont constitué la base de l'électronique quantique en tant que branche de la science, ont conduit à la création de générateurs moléculaires et d'amplificateurs d'ondes radio (masers) et de lumière - lasers (voir), qui sont largement utilisés dans de nombreux secteurs de l'économie nationale.

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K.N. Timofeev.

Les spectres RPE peuvent être utilisés pour déterminer la valence d'un ion paramagnétique et la symétrie de son environnement, ce qui, en combinaison avec des données d'analyse structurale aux rayons X, permet de déterminer la position de l'ion paramagnétique dans le réseau cristallin. La valeur des niveaux d'énergie d'un ion paramagnétique permet de comparer les résultats de RPE aux données de spectres optiques et de calculer les susceptibilités magnétiques des paramagnétiques.

La méthode EPR permet de déterminer la nature et la localisation des défauts de réseau, tels que les centres de couleur. Dans les métaux et les semi-conducteurs, la RPE est également possible, associée à une modification de l'orientation des spins des électrons de conduction. La méthode EPR est largement utilisée en chimie et en biologie, où au cours de réactions chimiques ou sous l'action de rayonnements ionisants, des molécules à liaison chimique non remplie, des radicaux libres, peuvent se former. Leur facteur g est généralement proche de , et la largeur de raie EPR
petit. En raison de ces qualités, l'un des radicaux libres les plus stables (), qui a g = 2,0036, est utilisé comme standard dans les mesures ESR. En biologie de la RPE, les enzymes et les radicaux libres dans les systèmes biologiques et les composés organométalliques sont étudiés.

1. EPR dans des champs magnétiques forts

La grande majorité des études expérimentales de résonance paramagnétique ont été réalisées dans des champs magnétiques dont l'intensité est inférieure à 20 ke. Pendant ce temps, l'utilisation de champs statiques plus forts et de champs alternatifs de fréquences plus élevées élargirait considérablement les possibilités de la méthode EPR et augmenterait les informations qu'elle fournit. Dans un avenir proche, des champs magnétiques permanents jusqu'à 250 ke et des champs impulsifs mesurés en dizaines de millions d'oersteds. Cela signifie que les dédoublements de Zeeman dans des champs constants atteindront environ 25
, et dans les champs pulsés, les valeurs sont deux ordres de grandeur plus grandes. Low, à l'aide d'un spectromètre avec un aimant supraconducteur, a mesuré l'EPR dans les champs H0 65 ke. Prokhorov et ses collègues ont observé des signaux EPR à une longueur d'onde =1,21millimètre.

Les champs magnétiques puissants devraient être d'un grand avantage pour l'émission d'ions de terres rares dans les cristaux, dont les intervalles entre les sous-niveaux de Stark sont de l'ordre de 10-100
. L'effet EPR dans les champs ordinaires est souvent absent parce que le niveau fondamental de Stark s'avère être un singulet, ou parce que les transitions entre les sous-niveaux Zeeman du doublet fondamental de Kramers sont interdites. L'effet dû aux transitions entre différents sous-niveaux de Stark est, en règle générale, possible. De plus, le champ cristallin dans les cristaux de terres rares est caractérisé par un grand nombre de paramètres, pour la détermination desquels la connaissance g- le tenseur du doublet de Kramers principal ne suffit pas.

Des champs magnétiques puissants peuvent également être utilisés pour étudier les ions du groupe du fer, en particulier, tels que

qui ont des découpages d'ordre 10 100
.

Lorsqu'ils sont appliqués à des paires couplées en échange, les champs magnétiques forts permettent, en observant l'effet dû aux transitions entre niveaux avec des valeurs différentes du spin résultant S des paires avec une précision spectroscopique mesurent le paramètre d'interaction d'échange J.

La résonance paramagnétique dans des champs magnétiques puissants aura un certain nombre de caractéristiques. Les effets de saturation de l'aimantation se produiront à des températures relativement élevées. A des températures pas très basses, la polarisation des moments magnétiques ioniques sera si forte qu'en plus du champ magnétique externe, il faudra introduire un champ interne dans les conditions de résonance. La dépendance des conditions de résonance sur la forme de l'échantillon apparaîtra.

La méthode EPR a acquis une grande importance en chimie, physique, biologie et médecine, car elle permet de déterminer les structures et les concentrations de radicaux libres organiques et inorganiques. Les radicaux libres peuvent être créés chimiquement, photochimiquement ou par rayonnement à haute énergie.

Le spectre EPR est donné par les radicaux libres, les molécules avec un nombre impair d'électrons, les états triplets des molécules organiques, les ions de métaux de transition paramagnétiques et leurs complexes.

La méthode EPR a commencé à être utilisée dans la recherche biologique dans les années 1950. En raison de sa sensibilité assez élevée et de la possibilité de déterminer la nature des particules paramagnétiques, cette méthode a trouvé une large application dans l'étude d'un certain nombre de processus biologiques.

En plus des signaux de radicaux libres, un certain nombre de signaux métalliques (Fe, Cu, Mn, Ni, Co) sont observés dans les tissus. Ces métaux font partie des métalloprotéines impliquées dans un certain nombre de processus enzymatiques. Les protéines contenant du fer (cytochromes, ferrédoxines) sont des composants des chaînes de transport d'électrons dans les mitochondries et les chloroplastes.

Un certain nombre de systèmes enzymatiques ont été étudiés par la méthode EPR et des produits radicalaires de substrats ont été trouvés. Dans un certain nombre de cas, il s'est avéré possible d'observer les transformations redox des ions métalliques inclus dans le centre actif de l'enzyme.

La spectroscopie RPE est largement utilisée dans les études de la photosynthèse : le mécanisme des étapes primaires de séparation de charge dans les centres de réaction et le transfert ultérieur d'un électron le long de la chaîne de transport d'électrons sont étudiés.

En plus d'étudier les mécanismes des réactions se produisant avec la participation de particules paramagnétiques, la méthode EPR est également largement utilisée pour étudier les propriétés structurelles et dynamiques des macromolécules et des biomembranes.

Récemment, les méthodes de "sonde paramagnétique", "spin labels" et "spin traps" sont souvent utilisées pour étudier les systèmes biologiques et polymériques. Tous sont basés sur l'utilisation de radicaux stables d'acide nitrique de diverses structures, ou plutôt sur l'analyse des modifications de la largeur de raie des spectres RPE provoquées par la diffusion rotationnelle et translationnelle de ces radicaux.

L'idée principale de la méthode spin label and probe est de fixer un radical libre sur l'un ou l'autre groupe fonctionnel d'une protéine et d'étudier les caractéristiques de ses signaux EPR. Les plus commodes à cet égard sont les radicaux nitroxyle contenant un groupe radical libre :

où R 1 et R 2 sont des groupes chimiques différents.

Méthode de l'étiquette rotative consiste dans le fait qu'un radical stable est lié à une molécule non paramagnétique par une liaison covalente ou autre de sorte que la valence libre n'est pas affectée. La nature du mouvement se manifeste clairement sous la forme du spectre et constitue une source importante d'informations sur la molécule d'origine.

Si une molécule est intégrée dans une molécule de protéine et y est maintenue par des forces électrostatiques ou des interactions hydrophobes, alors une telle molécule est appelée sonde de rotation. La méthode est basée sur l'étude de la mobilité rotationnelle et translationnelle du radical sonde en milieu aqueux ou organique ou dans la matrice polymère. La mobilité du radical dépend de la mobilité des molécules de l'environnement; par conséquent, le radical est une sorte de capteur moléculaire d'informations structurelles et dynamiques sur l'environnement local.

La forme du signal EPR produit par un marqueur ou une sonde de spin dépend du microenvironnement du radical nitroxy et, tout d'abord, de la mobilité rotationnelle du groupe dans lequel il est inclus.

Le principal inconvénient des marqueurs de spin et des sondes est que, bien que ces molécules soient petites, lorsqu'elles sont incluses dans la bicouche lipidique, elles modifient quelque peu ses propriétés.

Au coeur de la méthode "pièges à rotation" est la réaction d'une molécule non paramagnétique (piège) spécialement introduite dans le système étudié avec un radical à vie courte, qui aboutit à la formation d'un radical stable. Le comportement cinétique du radical stable résultant et sa structure fournissent des informations sur la cinétique et le mécanisme des processus dans le système à l'étude.

Les objets de recherche en chimie utilisant la spectroscopie RPE sont : 1) les radicaux libres dans les produits intermédiaires des réactions organiques ; 2) cinétique de réaction ; 3) chimie des phénomènes de surface ; 4) destruction résultant de l'irradiation ; 5) polymérisation due aux radicaux libres ; 6) radicaux libres congelés à basse température ; 7) les métaux de valence variable et leurs complexes.

La méthode RPE apporte une contribution précieuse à l'étude de la cinétique et des mécanismes des réactions chimiques. Premièrement, les mesures de largeur de raie dans les spectres RPE peuvent être utilisées pour déterminer les constantes de vitesse des processus impliquant des particules paramagnétiques dont la durée de vie caractéristique se situe dans la plage 10 -5 -10 -10 s. Deuxièmement, la méthode RPE permet de détecter des particules paramagnétiques avec une sensibilité élevée dans différentes conditions, ce qui fournit des informations précieuses sur les mécanismes de réaction. Troisièmement, le spectromètre EPR peut être utilisé comme dispositif analytique pour détecter la concentration de molécules paramagnétiques réagissant au cours des réactions. Le nombre de centres paramagnétiques dans un échantillon est proportionnel à la surface sous le spectre d'absorption.

La méthode EPR est largement utilisée pour étudier les processus rapides associés aux modifications de la structure moléculaire des radicaux. Ces processus comprennent la rotation entravée et les transitions conformationnelles.

Pour les radicaux à courte durée de vie, la sensibilité de la méthode peut être augmentée en utilisant un système à flux ou une irradiation continue. Les spectres RPE des radicaux instables peuvent être obtenus en les fixant dans des verres, des matrices de gaz nobles congelés ou des cristaux.

Questions d'entretien

1. Fondements théoriques de la méthode.

2. Paramètres analytiques du spectre RPE.

3. Spectromètres RPE.

4. Application de la REP.

Tâches de test

1. Condition de résonance dans la méthode EPR :

a) n = gH 0 (1-s) / 2p ; b) δ \u003d (ΔH / H 0) c) hn \u003d gβH 0; d) δ = (Δν/ν 0)/(ΔН/Н 0).

2. Que se passe-t-il au moment de la résonance dans la méthode EPR :

a) les quanta de rayonnement sont absorbés, la réorientation du spin ne se produit pas ;

b) les quanta de rayonnement sont absorbés et les spins sont réorientés, c'est-à-dire passage d'un état d'énergie inférieur à un état supérieur et vice versa. Le nombre de transitions de bas en haut est supérieur au nombre de transitions de haut en bas.

c) les quanta de rayonnement sont absorbés et les spins sont réorientés, c'est-à-dire passage d'un état d'énergie inférieur à un état supérieur et vice versa. Le nombre de transitions de haut en bas est supérieur au nombre de transitions de bas en haut.

3. Paramètres des spectres RPE :

a) facteur g, largeur de bande d'absorption, intensité de la raie d'absorption ;

b) nombre total de signaux, intensité du signal, déplacement chimique, multiplicité du signal ;

c) facteur g, largeur de bande d'absorption, intensité de la raie d'absorption, spectres RPE HFS.

SPÉCROMÉTRIE DE MASSE

Cette méthode est fondamentalement différente des méthodes spectroscopiques. Les méthodes de spectrométrie de masse sont basées sur l'ionisation d'une substance, la séparation des ions, selon le rapport ( m/z), et l'enregistrement de la masse des fragments résultants.

Les bases théoriques et expérimentales de la spectrométrie de masse ont été posées par D.D. Thomson, qui a créé pour la première fois en 1912 un appareil permettant d'obtenir le spectre de masse des ions positifs. Cependant, son appareil avait une faible résolution. Son élève F. Aston en 1918 a considérablement augmenté la résolution et a découvert pour la première fois des isotopes d'éléments sur son appareil. Presque simultanément avec F. Aston à Chicago, A. Dempster a construit le premier spectromètre de masse, dans lequel le champ magnétique transversal servait d'analyseur et les courants ioniques étaient mesurés par des méthodes électriques. Son schéma est également utilisé dans les appareils modernes.

L'ionisation des molécules doit être réalisée dans des conditions dans lesquelles l'ion formé, quel que soit le mode d'ionisation, ne subirait aucune collision avec d'autres molécules ou ions. Ceci est nécessaire pour établir la relation entre les propriétés de l'ion et de la molécule.

Méthodes d'ionisation

L'ionisation peut être réalisée par différentes méthodes.

1. Méthode d'ionisation par impact électronique (EI).

Il s'agit de la méthode la plus courante pour obtenir des ions en raison de la simplicité et de la disponibilité des sources d'ions et de leur efficacité élevée. Supposons qu'un flux d'électrons traverse les vapeurs de la substance, dont l'énergie peut être progressivement augmentée. Si cette énergie atteint un certain niveau, alors lorsqu'un électron entre en collision avec une molécule, un électron peut en être "assommé" avec la formation d'un ion moléculaire:

molécule polyatomique ion moléculaire (cation radicalaire)

L'énergie la plus basse des électrons de bombardement à laquelle la formation d'un ion à partir d'une molécule donnée est appelée énergie d'ionisation de la matière. L'énergie d'ionisation est une mesure de la force avec laquelle une molécule retient l'électron le moins lié à elle. Pour les molécules organiques, l'énergie d'ionisation est de 9 ÷ 12 eV.

Si l'énergie des électrons dépasse de manière significative l'énergie d'ionisation, l'ion moléculaire résultant reçoit un excès d'énergie, qui peut être suffisant pour rompre les liaisons qu'il contient. L'ion moléculaire se désintègre en particules de plus petite masse (fragments). Un tel processus est appelé fragmentation . Dans la pratique de la spectrométrie de masse, des électrons d'une énergie de 30÷100 eV sont utilisés, ce qui assure la fragmentation d'un ion moléculaire.

Ions moléculaires Ce sont des ions dont les masses sont égales à la masse de la molécule ionisée. Malheureusement, il n'existe pas de méthodes directes pour déterminer la structure des ions. Par conséquent, l'hypothèse sur l'identité de la structure de l'ion moléculaire (M +) et de la molécule neutre (M) est souvent utilisée. La probabilité de former un ion moléculaire est plus grande pour les petites molécules simples. Avec une augmentation du nombre d'atomes dans une molécule, la probabilité de fragmentation d'un ion moléculaire augmente.

Il existe deux principaux types de fragmentation d'un ion moléculaire - la dissociation et le réarrangement.

Dissociation- la désintégration d'un ion moléculaire avec préservation de l'enchaînement des liaisons. À la suite du processus, un cation et un radical se forment :

La dissociation des hydrocarbures conduit à des fragments avec des rapports m/z impairs.

regroupement accompagnée d'une modification de l'enchaînement des liaisons, entraînant la formation d'un nouveau cation radicalaire de masse plus faible et d'une molécule stable neutre (H 2 O, CO, CO 2, etc.) :

Le réarrangement des hydrocarbures et des composés contenant de l'oxygène conduit à un fragment avec un rapport m/z pair. La mesure de la masse des fragments résultants et de leur quantité relative fournit des informations précieuses sur la structure des composés organiques.

Considérons le dispositif du spectromètre de masse (Fig. 1). Le spectromètre de masse doit contenir des unités pour effectuer les fonctions suivantes : 1) ionisation de l'échantillon, 2) accélération des ions par un champ électrique, 3) distribution des ions selon le rapport m/z, 4) détection des ions par le signal électrique correspondant .

Fig. 1. Appareil de spectromètre de masse

1 - source d'électrons; 2 - chambre d'ionisation ; 3 - plaques accélératrices (potentiel négatif); 4 - aimant ; 5 - espace;

6 - collecteur d'ions (détecteur d'ions)

Pour obtenir un spectre de masse, des vapeurs de substances sont introduites dans la chambre d'ionisation en petites quantités à l'aide d'un système de soufflage spécial. (2) , où un vide profond est maintenu (pression 10 -6 mm Hg). Les molécules d'une substance sont bombardées par un flux d'électrons émis par une cathode chaude (1). Les ions résultants sont poussés hors de la chambre d'ionisation par une petite différence de potentiel (3). Le flux d'ions résultant est accéléré, focalisé par un fort champ électrique et entre dans un champ magnétique. (4).

À la suite du bombardement de molécules de matière par des électrons, il se forme des particules chargées positivement ou négativement, ainsi que des particules neutres. Lorsqu'un flux de particules traverse un champ magnétique, les particules neutres ne changent pas de direction, tandis que les particules positives et négatives sont déviées dans des directions différentes. La déviation des ions est proportionnelle à leur charge et inversement proportionnelle à leur masse.

Chaque ion individuel, caractérisé par une valeur spécifique de m/z, se déplace le long de sa propre trajectoire pour une intensité de champ magnétique donnée. L'intervalle de balayage de masse peut être modifié en faisant varier soit l'intensité du champ magnétique, soit le potentiel du champ électrique.

En spectrométrie de masse conventionnelle, il est d'usage d'enregistrer uniquement les particules qui ont une charge positive, car. lorsque les molécules sont bombardées d'électrons, il y a généralement plus d'ions chargés positivement que d'ions chargés négativement. S'il est nécessaire d'étudier des ions chargés négativement, le signe du potentiel d'accélération doit être modifié (plaques d'accélération).

Si un appareil d'enregistrement est installé à la sortie des ions du champ magnétique, les particules différant par les valeurs m/z donneront des signaux séparés. L'intensité du signal sera proportionnelle au nombre de particules avec une valeur m/z donnée. L'intensité des signaux est définie par leur hauteur exprimée en mm. La hauteur du pic d'intensité maximale est prise à 100% (pic de base), l'intensité des pics restants est recalculée proportionnellement et exprimée en pourcentage.

Avec une augmentation du rapport m/z, la différence de déviation par le champ magnétique des particules qui diffèrent d'une unité de masse atomique diminue. À cet égard, une caractéristique importante des spectromètres de masse est leur résolution (R) , qui détermine la masse maximale des ions qui diffèrent d'une unité de masse atomique (pour laquelle l'instrument sépare les pics d'au moins 90 %) :

où M est la masse maximale pour laquelle le recouvrement des pics est inférieur à 10 % ; ΔM est une unité de masse atomique.

Les appareils standard ont R ≈ 5000/1, et pour les appareils à double focalisation du flux ionique R ≈ 10000/1 et même plus. De tels dispositifs sont capables de capturer la différence de poids moléculaire des ions jusqu'à 0,0001. Un spectromètre de masse à double focalisation peut facilement séparer les pics d'ions ayant les mêmes poids moléculaires nominaux mais des compositions élémentaires différentes. Par exemple, il peut faire la distinction entre N 2 (28.0061), CO (27.9949) et C 2 H 4 (28.0313).

Établir une formule empirique à partir des données du spectre de masse n'est pas une tâche facile, mais elle peut être résolue à l'aide d'un algorithme approprié. Pour obtenir un spectre de masse, une quantité négligeable d'une substance est nécessaire - environ 1 μg.

2. Ionisation chimique (CI).

Dans cette méthode, l'échantillon est dilué avec un grand excès de "gaz réactif" avant l'irradiation avec un faisceau d'électrons. La probabilité de collisions ionisantes primaires entre les électrons et les molécules de l'échantillon est alors si faible que les ions primaires sont formés presque exclusivement à partir de molécules réactives. Des gaz de faible poids moléculaire tels que CH 4 , ISO-C 4 H 10 , NH 3 et des gaz inertes (Ar, He) sont généralement utilisés comme réactifs. Les ions secondaires se forment à la suite du transfert d'un atome d'hydrogène ou d'un électron.

Si le méthane est le gaz réactif, les réactions se déroulent dans l'ordre suivant :

CH 4 + ē → CH 4 + + 2ē

CH 4 + + ē → CH 3 + +H + + 2ē

CH 4 + + CH 4 → CH 5 + +CH3

CH3 + + CH 4 → C 2 H 5 + +H2

R-CH 3 + CH 5 + → R-CH 4 + +CH4

où R-CH 3 est la molécule de la substance d'essai.

Des études ont montré que les particules de CH 5 + et C2H5 + ensemble, ils constituent environ 90% des ions présents dans ce système. Les spectres de masse obtenus après ionisation chimique sont beaucoup plus simples, contiennent moins de pics et sont donc souvent plus faciles à interpréter.

La résonance paramagnétique électronique (RPE) est un phénomène d'absorption résonante d'un rayonnement électromagnétique par une substance paramagnétique placée dans un champ magnétique constant. Elle est causée par des transitions quantiques entre des sous-niveaux magnétiques d'atomes et d'ions paramagnétiques (effet Zeeman). Les spectres RPE sont observés principalement dans la gamme des fréquences micro-ondes.

La méthode de résonance paramagnétique électronique permet d'évaluer les effets qui apparaissent dans les spectres RPE dus à la présence de champs magnétiques locaux. À leur tour, les champs magnétiques locaux reflètent le modèle d'interactions magnétiques dans le système étudié. Ainsi, la méthode de spectroscopie RPE permet d'étudier à la fois la structure des particules paramagnétiques et l'interaction des particules paramagnétiques avec l'environnement.

Le spectromètre RPE est conçu pour enregistrer des spectres et mesurer les paramètres des spectres d'échantillons de substances paramagnétiques en phase liquide, solide ou pulvérulente. Il est utilisé dans la mise en œuvre de méthodes existantes et dans le développement de nouvelles méthodes d'étude de substances par la méthode EPR dans divers domaines de la science, de la technologie et de la santé : par exemple, pour étudier les caractéristiques fonctionnelles de fluides biologiques à partir des spectres de sondes de spin introduites dans ceux-ci. en médecine; détecter les radicaux et déterminer leur concentration; dans l'étude de la mobilité intramoléculaire dans les matériaux ; dans l'agriculture; en géologie.

Le dispositif de base de l'analyseur est une unité spectrométrique - un spectromètre à résonance paramagnétique électronique (spectromètre RPE).

L'analyseur offre la possibilité d'étudier des échantillons :

• avec régulateurs de température - systèmes de contrôle de la température des échantillons (y compris ceux dans la plage de température de -188 à +50 ºС et à la température de l'azote liquide);
• dans des cuvettes, des ampoules, des capillaires et des tubes à l'aide de systèmes automatiques de changement et de dosage d'échantillons.

Caractéristiques de fonctionnement du spectromètre EPR

Un échantillon paramagnétique dans une cellule spéciale (ampoule ou capillaire) est placé à l'intérieur d'un résonateur de travail situé entre les pôles de l'électroaimant du spectromètre. Un rayonnement électromagnétique micro-ondes de fréquence constante pénètre dans le résonateur. La condition de résonance est obtenue par un changement linéaire de l'intensité du champ magnétique. Pour augmenter la sensibilité et la résolution de l'analyseur, une modulation haute fréquence du champ magnétique est utilisée.

Lorsque l'induction du champ magnétique atteint une valeur caractéristique d'un échantillon donné, il se produit une absorption résonnante de l'énergie de ces oscillations. Le rayonnement converti va ensuite vers le détecteur. Après détection, le signal est traité et transmis à l'appareil d'enregistrement. La modulation haute fréquence et la détection sensible à la phase convertissent le signal EPR en la première dérivée de la courbe d'absorption, sous la forme de laquelle s'effectue l'enregistrement des spectres de résonance paramagnétique électronique. Dans ces conditions, la raie d'absorption EPR intégrée est également enregistrée. Un exemple du spectre d'absorption de résonance enregistré est illustré dans la figure ci-dessous.