Химический анализ лекарственных растений. Агрохимический анализ почв, растений, удобрений Подготовка проб почвы с исследуемых участков
Свойства всех растительных организмов и внутренние структуры, присущие отдельным видам, определяются многогранным, постоянно меняющимся воздействием окружающей среды. Существенно влияние таких факторов, как климат, почва, а также круговорот веществ и энергии. Традиционно для выявления свойств лечебных средств или продуктов питания определяются доли веществ, поддающихся выделению аналитическим способом. Но эти отдельно взятые вещества не могут охватить все внутренние свойства, например, лекарственных и пряноароматических растений. Поэтому такие описания отдельных свойств растений не могут удовлетворить всем нашим потребностям. Ятя исчерпывающего описания свойств растительных лечебных препаратов, включающего биологическую активность, требуется всестороннее, комплексное исследование. Существует ряд методик, позволяющих выявить качество и количество биологически активных веществ в составе растения, а также места их скопления.
Люминисцентно-микроскопический анализ эснован на том, что биологически активные вещества, содержащиеся в растении, дают в люминесцентном микроскопе яркое окрашенное свечение, причем различные химические вещества характеризуются разной окраской. Так, алкалоиды дают желтую окраску, а гликозиды - оранжевую. Этот метод используют в основном для выявления мест скопления активных веществ в тканях растений, а интенсивность свечения указывает на большую или меньшую концентрацию этих веществ. Фитохимический анализ предназначен для выявления качественного и количественного показателя содержания активных веществ в эастении. Для определения качества используют химические реакции. Количество действующих веществ в растении является главным показателем его доброкачественности, поэтому проводится их объемный анализ также с использованием химических методов. Для исследования растений, содержащих такие активные вещества, как алкалоиды, кумарины,
главоны, требующие не простого суммарного анализа, но и разделения их на компоненты, сэименяют хроматографический анализ. Хроматографический метод анализа был первые представлен в 1903 году ботаником
Цветом, и с тех пор разработаны его разчные варианты, имеющие самостоятельное
начение. Данный метод разделения смеси г-цеетв на компоненты основан на различите в их физических и химических свойствах. Фотографическим методом, с помощью пано рамной хроматографии можно сделать видимой внутреннюю структуру растения, увидеть линии, формы и цвета растения. Такие картины, получаемые из водяных экстрактов, задерживаются на серебристо-нитратной фильтровочной бумаге и репродуцируются. Метод интерпретации хроматограмм успешно развивается. Эта методика подкрепляется данными, полученными с помощью других, уже известных отработанных методик.
На основании циркуляционных хромодиа-грамм, продолжается разработка метода панорамной хроматографии для определения качества растения по наличию сконцентрированных в нем питательных веществ. Результаты, полученные при использовании этого метода, должны подкрепляться данными анализа уровня кислотности растения, взаимодействия содержащихся в его составе ферментов и т. д. Основной задачей дальнейшего развития хроматографического метода анализа растений должен стать поиск способов воздействия на растительное сырье в ходе его выращивания, первичной обработки, складирования и на этапе непосредственного получения лекарственных форм с целью повышения содержания в нем ценных активных веществ.
Обновлено: 2019-07-09 22:27:53
- Установлено, что адаптация организма к различным влияниям окружающей среды обеспечивается соответствующими колебаниями функциональной активности органов и тканей, центральной нервной
При определении потребности растений в удобрениях наряду с агрохимическими анализами почвы, полевыми и вегетационными опытами, микробиологическими и другими способами все больше и больше стали применяться методы растительной диагностики.
В настоящее время широко используются следующие методы растительной диагностики: 1) химический анализ растений, 2) визуальная диагностика и 3) инъекция и опрыскивание. Химический анализ растений - наиболее распространенный метод диагностики потребности во внесении удобрений.
Химическая диагностика представлена тремя видами: 1) листовой диагностикой, 2) тканевой диагностикой и 3) быстрыми (экспресс) методами анализа растений.
Важными этапами работы по растительной диагностике при помощи химического анализа являются: 1) взятие пробы растения для анализа; 2) учет сопутствующих условий произрастания растений; 3) химический анализ растений; 4) обработка аналитических данных и составление заключения о нуждаемости растений в удобрениях.
Взятие пробы растений для анализа. При отборе растений для анализа следует добиваться того, чтобы взятые растения соответствовали среднему состоянию растений на данном участке поля. Если посев однороден, то можно ограничиться одной пробой; если же имеются пятна лучше развитых или, наоборот, хуже развитых растений, то с каждого из таких пятен берут отдельную пробу для выяснения причины измененного состояния растения. Содержание питательных веществ в хорошо развитых растениях может быть использовано в этом случае как показатель нормального состава данного вида растений.
При проведении анализов необходимо унифицировать технику взятия и подготовки образца: взятие одинаковых частей растения по ярусности, положению на растении и по физиологическому возрасту.
Выбор части растения для анализа зависит от метода химической диагностики. Для получения достоверных данных необходимо брать пробы не менее чем с десяти растений.
У древесных культур в связи с особенностями их возрастных изменений взятие проб растений несколько сложнее, чем у полевых культур. Рекомендуется проводить исследования в следующие возрастные периоды: сеянцы, саженцы, молодые и плодоносящие растения. Следует брать листья, их черешки, почки, побеги или другие органы из верхней трети побегов со средней зоны кроны деревьев или кустарников одного возраста и бонитета, придерживаясь одного и того же порядка, а именно: или только с плодовых, или только с неплодовых побегов, или с побегов текущего прироста, или листья, находящиеся на прямом солнечном или на рассеянном свете. Все эти моменты должны быть учтены, так как все они влияют на химический состав листьев. Отмечается, что лучшая корреляция между химическим составом листа и урожаем плодов получается в том случае, если в качестве пробы брать лист, в пазухе которого развивается цветочная почка.
В какую фазу развития растения следует брать образцы для анализа? Если иметь в виду получение наилучшей корреляции с урожаем, то анализ растений в фазу цветения или созревания оказывается наилучшим. Так, Люндегорд, Коларжик и другие исследователи считают, что такой фазой для всех растений является цветение, так как к этому моменту основные ростовые процессы заканчиваются и прирост массы не будет «разбавлять» процентное содержание веществ.
Для решения задачи, как изменить питание растений, чтобы обеспечить формирование наилучшего урожая, надо анализировать растения в более ранние периоды развития и не один раз, а несколько (три-четыре), начиная с появления одного-двух листьев.
Время взятия проб. I срок: для яровых зерновых (пшеницы, овса, кукурузы) - в фазу трех листьев, т. е. до начала дифференциации зачаточного колоса или метелки; для льна - начало «елочки»; для картофеля, бобовых, хлопчатника и других - фаза четырех-пяти настоящих листьев, т. е. до бутонизации; для сахарной свеклы - фаза трех настоящих листьев.
II срок: для яровых зерновых - в фазу пяти листьев, т. е. в фазу трубкования; для свеклы - в фазу развертывания шестого листа; для всех остальных - при образовании первых мелких зеленых бутонов, т. е. к самому началу бутонизации.
III срок: в фазу цветения; для свеклы - при развертывании восьмого-девятого листа.
IV срок: в фазу молочной спелости семян; для свеклы - за неделю до уборки.
У древесных растений и ягодников пробы берут по следующим фазам формирования урожая: а) до цветения, т. е. в начале сильного роста, б) цветение, т. е. в период сильного роста и физиологического осыпания завязей, в) образование плодов, г) созревание и уборка урожая и д) период осеннего листопада.
При установлении срока взятия пробы растений необходимо также учитывать, на какой период роста и развития приходятся критические уровни питания. Под термином «критические уровни» понимают наименьшие концентрации питательных веществ в растениях в ответственный период их развития, т. е. концентрации, ниже которых наступает ухудшение состояния растения и снижение урожая. Под оптимальным составом растения понимают такое содержание в нем питательных веществ в ответственные фазы его развития, при котором обеспечивается получение высокого урожая.
Величины критических уровней и оптимального состава приведены для некоторых культур ниже. Пробы берут во всех случаях в одни и те же часы суток, лучше утром (в 8-9 час), чтобы избежать изменений состава растений за счет суточного режима питания.
Учет сопутствующих условий. Судить о достаточности или недостаточности питания растений теми или другими элементами только по данным химического анализа не всегда правильно. Известно немало фактов, когда недостаток одного или нескольких элементов питания, задержка фотосинтеза или нарушение водного, теплового и других жизненно важных режимов может вызвать накопление того или иного элемента в растении, что ни в коем случае не должно характеризовать достаточность этого элемента в питательной среде (почве). Чтобы избежать возможных ошибок и неточностей в выводах, необходимо данные химического анализа растений сопоставить с рядом других показателей: с весом, ростом и темпом развития растений в момент взятия пробы и с конечным урожаем, с визуальными диагностическими признаками, с особенностями агротехники, с агрохимическими свойствами почвы, с условиями погоды и рядом других показателей, влияющих на питание растений. Поэтому одним из важнейших условий успешного использования растительной диагностики является наиболее подробный учет всех этих показателей для последующего сопоставления их между собой и с данными анализа.
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ИНФОРМАЦИОННО-АНАЛИТИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ПРИРОДООХРАННОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ
Учебно-методическое пособие для вузов
Составители: Л.И. Брехова Л.Д. Стахурлова Д.И. Щеглов А.И. Громовик
ВОРОНЕЖ – 2009
Утверждено Научно-методическим советом биолого-почвенного факультета - протокол № 10 от 4 июня 2009 г.
Рецензент д.б.н., профессор Л.А. Яблонских
Учебно-методическое пособие подготовлено на кафедре почвоведения и управления земельными ресурсами биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета.
Для специальности: 020701 - Почвоведение
Недостаток или избыток любого химического элемента вызывает нарушение нормального хода биохимических и физиологических процессов в растениях, что в конечном итоге изменяет урожайность и качество растениеводческой продукции. Поэтому определение химического состава растений и показателей качества продукции позволяет идентифицировать неблагоприятные экологические условия произрастания как культурной, так и естественной растительности. В связи с этим химический анализ растительного материала является неотъемлемой частью природоохранной деятельности.
Практическое пособие по информационно-аналитическому обеспечению природоохранной деятельности в сельском хозяйстве составлено в соответствии с программой лабораторных занятий по «Биогеоценологии», «Анализу растений» и «Природоохранной деятельности в сельском хозяйстве» для студентов 4-го и 5-го курсов почвенного отделения биологопочвенного факультета ВГУ.
МЕТОДИКА ВЗЯТИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ПРОБ И ПОДГОТОВКА ИХ К АНАЛИЗУ
Взятие проб растений является весьма ответственным моментом в результативности диагностики питания растений и оценки доступности им почвенных ресурсов.
Всю площадь исследуемого посева визуально делят на несколько участков в зависимости от ее размера и состояния растений. Если в посеве выделяются участки с явно худшими растениями, то на карте поля отмечаются эти участки, выясняют, не является ли плохое состояние растений следствием энтоили фитозаболевания, местного ухудшения свойств почвы или других условий роста. Если все эти факторы не объясняют причины плохого состояния растений, то можно предположить, что нарушено их питание. Это проверяется методами растительной диагностики. Берут про-
бы с участков с самыми худшими и самыми лучшими растениями и почвы под ними и по их анализам выясняют причины ухудшения растений и уровень их питания.
Если по состоянию растений посев не однороден, то при отборе проб следует добиваться, чтобы образцы соответствовали среднему состоянию растений на данном участке поля. С каждого выделенного массива по двум диагоналям берут растения с корнями. Они используются: а) для учета прироста массы и хода образования органов – будущей структуры урожая и б) для химической диагностики.
В ранние фазы (при двух – трех листьях) в пробе должно быть не менее 100 растений с 1 га. Позже для зерновых, льна, гречихи, гороха и других – не менее 25 – 30 растений с 1 га. У крупных растений (взрослых кукурузы, капусты и др.) берут нижние здоровые листья не менее, чем с 50 растений. Чтобы учесть накопление по фазам и вынос урожаем, берут в анализ всю надземную часть растения.
У древесных пород – плодовых, ягодников, винограда, декоративных и лесных – в связи с особенностями их возрастных изменений, периодичности плодоношения и т. д. взятие проб несколько сложнее, чем у полевых культур. Выделяют следующие возрастные группы: сеянцы, дички, привитые двухлетки, саженцы, молодые и плодоносящие (начавшие плодоносить, в полном и в затухающем плодоношении) деревья. У сеянцев в первый месяц их роста в пробу входит целиком все растение с последующим разделением его на органы: листья, стволики и корни. Во второй и следующие месяцы отбирают вполне сформировавшиеся листья, обычно – первые два после самых молодых, считая от верхушки. У двухлетних дичков также берут первые два сформировавшихся листа, считая от верхушки ростового побега. У привитых двухлеток и саженцев берут, так же как и у взрослых, средние листья ростовых побегов.
У ягодников – крыжовника, смородины и других – отбирают с побегов текущего прироста по 3 – 4 листа с 20 кустов с тем, чтобы в пробе
было не менее 60 – 80 листьев. У земляники в том же количестве отбирают взрослые листья.
Общим требованием является унификация техники отбора, обработки и хранения проб: взятие со всех растений строго одних и тех же частей по их ярусности, возрасту, расположению на растении, отсутствию заболевания и т.д. Имеет значение также, находились ли листья на прямом солнечном свету или в тени, причем во всех случаях должны быть отобраны листья одинакового размещения по отношению к солнечному освещению, лучше на свету.
При анализе корневой системы среднюю лабораторную пробу перед взвешиванием осторожно промывают в водопроводной воде, споласкивают в дистиллированной воде и подсушивают фильтровальной бумагой.
Лабораторная проба зерна или семян берется из множества мест (мешка, ящика, машины) щупом, затем ее распределяют ровным слоем на бумаге в виде прямоугольника, делят на четыре части и берут материал из двух противоположных частей до нужного количества для анализа.
Одним из важных моментов в подготовке растительного материала к анализу является правильная фиксация его, если анализы не предполагается проводить в свежем материале.
Для химической оценки растительного материала по общему содержанию элементов питания (N, P, K, Ca, Mg, Fe и др.) образцы растений высушивают до воздушно-сухого состояния в сушильном шкафу при тем-
пературе 50 – 60 ° или на воздухе.
В анализах, по результатам которых будут сделаны выводы о состоянии живых растений, следует использовать свежий материал, так как завядание вызывает существенное изменение состава вещества или уменьшение его количества и даже исчезновение веществ, содержащихся в
живых растениях. Например, целлюлоза не затрагивается разрушением, а крахмал, белки, органические кислоты и особенно витамины подвергаются разложению после нескольких часов завядания. Это заставляет экспериментатора проводить анализы в свежем материале в очень короткие сроки, что не всегда можно сделать. Поэтому часто используют фиксацию растительного материала, цель которой заключается в стабилизации нестойких веществ растений. Решающее значение при этом имеет инактивация ферментов. Используются различные приемы фиксации растений в зависимости от задач опыта.
Фиксация паром. Этот вид фиксации растительного материала применяется тогда, когда нет необходимости определения воднорастворимых соединений (клеточного сока, углеводов, калия и др.). Во время обработки сырого растительного материала может происходить такой сильный автолиз, что состав конечного продукта иногда значительно отличается от состава исходного материала.
Практически фиксацию паром проводят следующим образом: внутри водяной бани подвешивается металлическая сетка, сверху баня покрывается плотным негорючим материалом и вода нагревается до бурного выделения пара. После этого на сетку внутри бани помещается свежий растительный материал. Время фиксации 15 – 20 мин. Затем растения высуши-
ваются в термостате при температуре 60°.
Температурная фиксация. Растительный материал помещают в пакеты из плотной бумаги типа «крафт», а сочные плоды и овощи в измельченном виде рыхло укладывают в эмалированные или алюминиевые кюветы. Материал выдерживают 10 – 20 мин при температуре 90 - 95°. При этом инактивируется большая часть ферментов. После этого потерявшую тургор листостебельную массу и плоды высушивают в сушильном шкафу при температуре 60° с вентиляцией или без нее.
При использовании этого метода фиксации растений необходимо помнить, что длительное высушивание растительного материала при тем-
пературе 80° и выше приводит к потерям и изменениям веществ вследствие химических превращений (термического разложения некоторых веществ, карамелизации углеводов и т. д.), а также вследствие летучести аммонийных солей и некоторых органических соединений. Помимо этого, температура сырого растительного материала не может достигнуть температуры окружающей среды (сушильного шкафа), пока не испарится вода и пока все подводимое тепло не перестанет превращаться в скрытую теплоту парообразования.
Быстрое и осторожное высушивание растительной пробы в ряде случаев также считают приемлемым и допустимым методом фиксации. При умелом проведении этого процесса отклонения в составе сухого вещества могут быть небольшими. При этом происходит денатурация белков и инактивация ферментов. Как правило, сушку проводят в сушильных шкафах (термостатах) или специальных сушильных камерах. Значительно быстрее и надежнее высушивается материал, если через шкаф (камеру) циркулирует нагретый воздух. Наиболее подходящая температура для высу-
шивания от 50 до 60°.
Высушенный материал лучше сохраняется в темноте и на холоде. Поскольку многие содержащиеся в растениях вещества способны самоокисляться даже в сухом состоянии, рекомендуется хранить высушенный материал в плотно закрывающихся сосудах (склянках с притертой пробкой, эксикаторах и др.), доверху заполненных материалом, чтобы в сосудах не оставалось много воздуха.
Замораживание материала. Растительный материал очень хорошо сохраняется при температуре от –20 до -30°, при условии, что замораживание происходит достаточно быстро (не более 1 часа). Преимущество хранения растительного материала в замороженном состоянии обусловлено как действием охлаждения, так и обезвоживанием материала вследствие перехода воды в твердое состояние. Надо учитывать, что при заморажива-
нии ферменты инактивируются лишь временно и после оттаивания в растительном материале могут происходить ферментативные превращения.
Обработка растений органическими растворителями. В качест-
ве фиксирующих веществ можно использовать кипящий спирт, ацетон, эфир и др. Фиксация растительного материала этим способом проводится опусканием его в соответствующий растворитель. Однако при этом методе происходит не только фиксация растительного материала, но и экстракция ряда веществ. Поэтому применять такую фиксацию можно только тогда, когда заранее известно, что вещества, которые нужно определять, не извлекаются данным растворителем.
Высушенные после фиксации растительные пробы измельчаются ножницами, а затем на мельнице. Измельченный материал просеивается через сито с диаметром отверстий 1 мм. При этом из пробы ничего не выбрасывается, так как удаляя часть материала, не прошедшего через сито с первого просеивания, мы тем самым меняем качество средней пробы. Крупные частицы пропускаются через мельницу и сито повторно. Остатки на сите следует растереть в ступке.
Из подготовленной таким образом лабораторной средней пробы берут аналитическую пробу. Для этого растительный материал, распределенный тонким ровным слоем на листе глянцевой бумаги, делят по диагоналям на четыре части. Затем два противоположных треугольника убирают, а оставшуюся массу вновь распределяют тонким слоем на всем листе бумаги. Снова проводят диагонали и опять убирают два противоположных треугольника. Так поступают до тех пор, пока на листе не останется количество вещества, которое необходимо для аналитической пробы. Отобранная аналитическая проба переносится в стеклянную банку с притертой пробкой. В таком состоянии она может храниться неопределенно долгое время. Вес аналитической пробы зависит от количества и методики исследований и колеблется от 50 до нескольких сот граммов растительного материала.
Все анализы растительного материала должны проводиться с двумя параллельно взятыми навесками. Только близкие результаты могут подтвердить правильность проведенной работы.
Работать с растениями нужно в сухой и чистой лаборатории, не содержащей паров аммиака, летучих кислот и других соединений, могущих оказать влияние на качество пробы.
Результаты анализов могут быть рассчитаны как на воздушносухую, так и на абсолютно сухую навеску вещества. При воздушно-сухом состоянии количество воды в материале находится в равновесии с парами воды в воздухе. Эта вода называется гигроскопической, и количество ее зависит как от растения, так и от состояния воздуха: чем влажнее воздух, тем больше гигроскопической воды в растительном материале. Для пересчета данных на сухое вещество необходимо определять количество гигроскопической влаги в пробе.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУХОГО ВЕЩЕСТВА И ГИГРОСКОПИЧЕСКОЙ ВЛАГИ В ВОЗДУШНО-СУХОМ МАТЕРИАЛЕ
При химическом анализе количественное содержание той или иной составной части рассчитывается на сухое вещество. Поэтому перед анализом определяют количество влаги в материале и тем самым находят количество в нем абсолютно сухого вещества.
Ход анализа. Аналитическую пробу вещества распределяют тонким слоем на листе глянцевой бумаги. Затем шпателем из разных мест распределенного на листе вещества берут небольшие щепотки его в предварительно высушенный до постоянного веса стеклянный бюкс. Навеска должна составлять примерно 5 г. Бюкс вместе с навеской взвешивают на аналитических весах и помещают в термостат, температуру внутри которого поддерживают на уровне 100-1050 . Первый раз в термостате открытый бюкс с навеской держат в течение 4-6 часов. По истечении этого времени бюкс из термостата переносят в эксикатор для охлаждения, через 20-30
минут бюкс взвешивают. После этого бюкс открывают и снова помещают в термостат (при той же температуре) на 2 часа. Высушивание, охлаждение и взвешивание повторяют до тех пор, пока бюкс с навеской не достигнет постоянного веса (разница между двумя последними взвешиваниями должна быть меньше 0,0003 г).
Вычисление процента воды производят по формуле:
где: х – процент воды; в – навеска растительного материала до высушивания, г; в1 – навеска растительного материала после высушивания.
Оборудование и посуда :
1) термостат;
2) стеклянные бюксы.
Форма записи результатов
Вес бюкса с |
Вес бюкса с |
||||||||
навеской по- |
|||||||||
навеской до |
Навеска до |
Навеска по- |
|||||||
сле высуши- |
|||||||||
высушива- |
высушива- |
сле высу- |
|||||||
шивания, г |
|||||||||
ОПРЕДЕЛЕНИЕ «СЫРОЙ» ЗОЛЫ МЕТОДОМ СУХОГО ОЗОЛЕНИЯ
Золой называют остаток, получаемый после сжигания и прокаливания органических веществ. При сжигании углерод, водород, азот и частично кислород улетучиваются и остаются лишь нелетучие оксиды.
Содержание и состав зольных элементов растений зависит от видовой принадлежности, роста и развития растений и особенно от почвенноклиматических и агротехнических условий их выращивания. Концентрация зольных элементов существенно отличается в разных тканях и органах растений. Так, содержание золы в листьях и травянистых органах растений значительно выше, чем в семенах. В листьях золы больше, чем в стеблях,
Еще в начале XVI в. была установлена важная истина: лечебные свойства каждого растения определяются его химическим составом , т. е. наличием в нем тех или иных веществ, оказывающих определенное воздействие на организм человека. В результате анализа многочисленных фактов удалось выявить определенные фармакологические свойства и спектр терапевтического действия многих групп химических соединений, называемых действующими веществами . Важнейшие из них - алкалоиды, гликозиды сердечного действия, тритерпеновые гликозиды (сапонины), флавоноиды (и другие фенольные соединения), кумарины, хиноны, ксангоны, сесквитерпеновые лактоны, лигнаны, аминокислоты, полисахариды и некоторые другие соединения. Из 70 групп известных сейчас природных соединений нас часто интересует лишь, несколько групп, обладающих биологической активностью. Это ограничивает возможности выбора и тем самым ускоряет поиски нужных нам природных химических веществ. Например, противовирусной активностью обладают лишь некоторые группы флавоноидов, ксантонов, алкалоидов, терпеноидов и спиртов; противоопухолевой - некоторые алкалоиды, цианиды, тритерпеновые кетоны, дитерпеноиды, полисахариды, фенольные соединения и др. Полифенольным соединениям свойственна гипотензивная, спазмолитическая, противоязвенная, желчегонная и бактерицидная активность. Многие классы химических соединений и индивидуальные химические вещества обладают строго определенным и довольно ограниченным спектром медико-биологической активности. Другие же, обычно очень обширные классы, например алкалоиды , имеют очень широкий, разнообразный спектр действия. Такие соединения заслуживают разностороннего медико-биологического изучения и прежде всего в интересующих нас направлениях, рекомендуемых . Успехи аналитической химии позволили разработать несложные и быстрые методы (экспресс-методы) выявления в нужных нам классов (групп) химических соединений и отдельных химических веществ. В результате этого возник и широко внедрился в практику поисковых работ метод массовых химических анализов, иначе называемый химическим скринингом (от английского слова screening - просеивание, сортировка через решето). Нередко он практикуется для поиска нужных химических соединений путем анализа всех растений исследуемого района.
Метод химического скрининга
Метод химического скрининга в сочетании с данными об использовании растения в эмпирической медицине и с учетом его систематического положения дает наиболее эффективные результаты. Опыт говорит о том, что почти все растения, используемые в эмпирической медицине, содержат известные нам классы биологически активных соединений. Поэтому поиск нужных нам веществ прежде всего, следует целенаправленно вести среди растений, чем-либо обнаруживших свою фармакологическую или химиотерапевтическую активность. Экспресс-метод может сочетаться с предварительным отбором перспективных видов, разновидностей и популяций в результате их органолептической оценки и анализа этноботанических данных, косвенно свидетельствующих о наличии в растении интересующих нас веществ. Подобный метод отбора широко использовал академик Н. И. Вавилов при оценке качества исходного материала различных полезных растений, привлекаемых для селекционно-генетических исследований. В годы первых пятилеток таким путем проводились поиски во флоре СССР новых каучуконосных растений.
Впервые в широких масштабах метод химического скрининга
при поисках новых лекарственных растений начал применять начальник среднеазиатских экспедиций Всесоюзного научно-исследовательского химико-фармацевтического института (ВНИХФИ) П. С. Массагетов. Обследование более 1400 видов растений позволило академику А. П. Орехову и его ученикам к 19G0 г. описать около 100 новых алкалоидов и организовать в СССР производство тех из них, которые необходимы для медицинских целей и борьбы с сельскохозяйственными вредителями. Институт химии растительных веществ АН Узбекской ССР обследовал около 4000 видов растений, выявил 415 алкалоидов, впервые установил строение 206 из них.
Экспедициями ВИЛР обследовано 1498 видов растений Кавказа, 1026 видов Дальнего Востока, многие растения Средней Азии, Сибири, европейской части СССР. Только на Дальнем Востоке обнаружено 417 алкалоидо-носных растений, в их числе секуринега полукустарниковая, содержащая новый алкалоид секуринин - средство стрихниноподобного действия. К концу 1967 г. во всем мире было описано и установлена структура 4349 алкалоидов.
Следующий этап поиска - углубленная разносторонняя оценка фармакологической, химиотерапевтической и противоопухолевой активности
выделенных индивидуальных веществ или содержащих их суммарных препаратов. Надо отметить, что в целом по стране и в мировом масштабе химические исследования значительно опережают возможности глубокой медико-биологической апробации новых химических соединений, выявленных в растениях.
В настоящее время установлена структура 12 000 индивидуальных соединений, выделенных из растений, к сожалению, многие из них еще не подвергались медико-биологическому изучению. Из всех классов, химических соединений наибольшее значение, безусловно, имеют алкалоиды; 100 из них рекомендованы как важные медицинские средства, например, атропин, берберин, кодеин, кокаин, кофеин, морфин, папаверин, пилокарпин, платифиллин, резерпин, сальсолин, секуренин, стрихнин, хинин, цитизин, эфедрин и др. Большинство этих препаратов получено в результате поисков, в основе которых лежал химический скрининг.
Однако настораживает одностороннее развитие этого метода, во многих институтах и лабораториях низведенного до поисков лишь алкалоидоносных растений, Нельзя забывать о том, что, помимо алкалоидов, ежегодно выявляются новые биологически активные растительные вещества, относящиеся к другим классам химических соединений. Если до 1956 г. была известна структура лишь 2669 природных соединений из растений, не относящихся к алкалоидам, то в последующие 5 лет (1957-1961 гг.) в растениях было найдено еще 1754 индивидуальных органических вещества. Сейчас число химических веществ с установленной структурой достигает 7000, что вместе с алкалоидами составляет свыше 12 000 растительных веществ.
Химический скрининг
медленно выходит из «алкалоидного периода». Из 70 групп и классов растительных веществ, известных в настоящее время (Karrer et. al., 1977 г.), он проводится лишь в 10 классах соединений, ибо отсутствуют надежные и быстрые экспресс-методы установления наличия в растительном сырье других соединений. Вовлечение в химический скрининг новых классов биологически активных соединений - важный резерв повышения темпов и эффективности поиска новых лекарств из растений. Очень важна разработка методов быстрого поиска отдельных химических веществ, например, берберина, рутина, аскорбиновой кислоты, морфина, цитизина и др.
Наибольший интерес при создании новых лечебных препаратов представляют вторичные соединения, или так называемые вещества специфического биосинтеза. Многие из них обладают широким спектром биологической активности.
Например, алкалоиды разрешены для применения в медицинской практике в качестве аналептиков, болеутоляющих, седативных, гипотензивных, отхаркивающих, желчегонных, спазмолитических, маточных, тонизирующих центральную нервную систему и адреналиноподобных препаратов. Флавоноиды способны укреплять стенки капилляров, понижать тонус гладкой мускулатуры кишечника, стимулировать секрецию желчи, повышать обезвреживающую функцию печени, некоторым из них присуще спазмолитическое, кардиотоническое и противоопухолевое действие.
Многие полифенольные соединения используют как гипотензивные, спазмолитические, противоязвенные, желчегонные и антибактериальные средства. Противоопухолевая активность отмечена у цианидов (например, содержащихся в семенах персика и др.), тритерпеновых кетонов, дитерпеноидов, полисахаридов, алкалоидов, фенольных и других соединений. Все больше препаратов создают из сердечных гликозидов, аминокислот, спиртов, кумаринов. полисахаридов, альдегидов, сесквитерпеновых лактонов, стероидных соединений.
Нередко медицинское применение находят уже давно известные химические вещества, у которых лишь недавно удалось обнаружить ту или иную медико-биологическую активность и разработать рациональный метод изготовления препаратов.
Химический скрининг позволяет не только наметить новые перспективные для изучения объекты, но и:
- выявить корреляции между систематическим положением растения, его химическим составом и медико-биологической активностью;
- выяснить географические и экологические факторы, способствующие или препятствующие накоплению в растениях тех или иных действующих веществ;
- определить значение биологически активных веществ для производящих их растений;
- выявить у растений химические расы, наследственно отличающиеся друг от друга наличием тех или иных действующих веществ.
Исследование органов растений
Разные органы растения нередко различаются не только количественным содержанием действующих веществ, но и их качественным составом. Например, алкалоид синоменин содержится лишь в траве луносемянника даурского, а цитизин - лишь в плодах термопсиса ланцетовидного, отсутствуя в его наземных частях до окончания цветения растений, в то время как у термопсиса очередноцветкового цитизин в большом количестве содержится в надземных частях во все фазы развития растения. Именно поэтому для получения полной картины химического состава каждого растения нужно сделать анализ не менее четырех его органов: подземных (корни, корневища, луковицы, клубни), листьев и стеблей (у трав листья всегда богаче действующими веществами, чем стебли), цветков (или соцветий), плодов и семян. У древесно-кустарниковых растений действующие вещества часто накапливаются в коре стеблей (и корней), а иногда лишь во всходах, некоторых частях цветка, плода и семени.
Химический состав каждого органа растения значительно колеблется также и в разные фазы его развития. Максимум содержания одних веществ наблюдается в фазу бутонизации
, других - в фазу полного цветения
, третьих - во время плодоношения
и др.
Например, алкалоид триакантин содержится в значительных количествах только в распускающихся листьях гледичии трехколючковой, в то время как в другие фазы развития во всех органах этого растения он практически отсутствует. Таким образом, несложно подсчитать, что для выявления, например, только полного списка алкалоидоносных растений флоры СССР, насчитывающей около 20 000 видов, нужно сделать не менее 160 000 анализов (20 000 видов X 4 органа X 2 фазы развития), что потребует около 8000 дней работы 1 лаборанта-аналитика.
Примерно столько же времени нужно затратить, чтобы определить наличие или отсутствие во всех растениях флоры СССР флавоноидов, кумаринов, сердечных гликозидов, таннидов, полисахаридов, тритерпеновых гликозидов и каждого другого класса химических соединений, если проводить анализы без предварительной выбраковки растений по тем или иным соображениям.
Кроме того, одинаковые органы в той же фазе развития растения в одном районе могут иметь нужные действующие вещества, а в другом районе - не иметь их. Помимо географических и экологических факторов (влияние температуры, влажности, инсоляции и др.), здесь может сказаться наличие у данного растения особых химических рас, совершенно не различимых по морфологическим признакам.
Все это очень усложняет задачу и, казалось бы, делает перспективы окончания предварительной химической оценки флоры СССР, а тем более всего земного шара весьма отдаленными. Однако знание определенных закономерностей позволяет значительно упростить эту работу. Во-первых, совершенно не обязательно исследовать все органы во все фазы развития. Достаточно анализировать каждый орган в оптимальную фазу, когда он содержит наибольшее количество исследуемого вещества.
Например, предыдущими исследованиями установлено, что листья и стебли наиболее богаты алкалоидами в фазу бутонизации, кора - в период весеннего сокодвижения, а цветки - в фазу их полного распускания. Плоды и семена, правда, могут содержать разные алкалоиды и в разном количестве в зрелом и незрелом состоянии, и поэтому по возможности их надо исследовать дважды. Знание этих закономерностей значительно упрощает работы по предварительной химической оценке растений.
Сплошное обследование всех видов
- способ действенный, но все же это работа вслепую! Можно ли, не проводя даже простейшего химического анализа, отличить группы растений, предположительно содержащие тот или иной класс химических соединений, от заведомо не содержащих этих веществ? Иными словами, можно ли на глаз определить химический состав растений? Как будет сказано в следующем разделе нашей брошюры, в общих чертах на этот вопрос мы можем ответить положительно.
Химический анализ растений за последние годы получил признание и большое распространение во многих странах мира как метод исследования питания растений в полевой обстановке и как метод определения потребности растений в удобрениях. Преимуществом этого метода является хорошо выраженная зависимость между показателями анализа растений и эффективностью соответствующих удобрений. Для анализа берут не все растение, а какую-нибудь определенную часть, чаще лист или черешок листа. Этот метод называется листовой диагностикой.[ ...]
Химический анализ растений проводится для определения количества поступивших в них элементов питания, по которому можно судить о необходимости применения удобрений (методы Нейбауэра, Магницкого и др.), определения показателей пищевого и кормового достоинства продукции (определения крахмала, сахара, белка, витаминов и т. п) и для решения различных вопросов питания растений и обмена веществ.[ ...]
Подкормка растений меченым азотом в этом опыте производилась через 24 дня после появления всходов. В качестве подкормки применялся сульфат аммония с трехкратным обогащением изотопом Ы15 в дозе 0,24 г N на сосуд. Так как внесенный подкормку меченый сульфат аммония разбавлялся в почве обычным сульфатом аммония, внесенным перед посевом и не полностью использованным растениями, то фактическое обогащение сульфата аммония в субстрате было несколько ниже, примерно 2,5. Из таблицы 1, в которой помещены урожайные данные и результаты химического анализа растений, следует, что при экспозиции растений на меченом азоте от 6 до 72 часов вес растений практически оставался на одном и том же уровне и только через 120 часов после внесения азотной подкормки он заметно увеличился.[ ...]
До настоящего времени в химическ >й таксономии не удается разделить растения на крупные таксономические группы на основании какого-либо химического соединения или группы соединений. Химическая таксономия исходит из химического анализа растений. Главное внимание до сих пор уделялось европейским растениям и растениям умеренного пояса, систематическое же исследование тропических растений было недостаточным. В последнее десятилетие, однако, приобретает все большее значение главным образом биохимическая систематика, а именно по двум причинам. Одной из них является удобство применения быстрых, простых и хорошо воспроизводимых химико-аналитических методов изучения состава растений (к этим методам относятся, например, хроматография и электрофорез), второй - простота идентификации органических соединений в растениях; оба эти фактора содействовали решению таксономических проблем.[ ...]
При обсуждении результатов химического анализа растений мы указывали, что по этим данным невозможно было установить какие-либо закономерности в изменении содержания запасных белков в растениях при различных сроках их уборки. Результаты изотопного анализа, наоборот, указывают на сильное обновление азота этих (белков через 48 и 96 часов после внесения подкормки с меченым азотом. Это заставляет нас признать, что в действительности запасные белки, так же как и конституционные, подвергались непрерывным изменениям в организме растений. И если в первые сроки после уборки изотопный соста-в азота запасных белков не менялся, то это не основание для того, чтобы делать вывод об известной их устойчивости в эти сроки опыта.[ ...]
Проводившиеся одновременно химические анализы растений показали, что общее количество белкового азота как в этом, так и в другом аналогичном опыте за столь короткие промежутки времени практически почти совсем не изменялось или изменялось на сравнительно незначительную величину (в пределах 5-10%). Это свидетельствует о том, что в растениях, кроме образования нового количества белка, постоянно происходит обновление уже содержащегося в растении белка. Таким образом, молекулы белка в организме растений имеют сравнительно небольшую продолжительность жизни. Они непрерывно разрушаются и вновь воссоздаются в процессе интенсивного обмена веществ растений.[ ...]
Указанные методы диагностики питания по химическому анализу растений основаны на определении в листьях валового содержания главных элементов питания. Отобранные образцы растений высушивают и размалывают. Затем в лабораторных условиях навеску растительного материала озоляют с последующим определение валового содержания N, Р205, КгО> CaO, MgO и других питательных веществ. В параллельной навеске определяют количество влаги.[ ...]
В таблице 10 приведены урожайные данные и данные химического анализа растений для обеих серий опыта.[ ...]
Однако во всех этих опытах в анализ поступали средние пробы растений, как это делается при обычных определениях размеров усвоения растениями фосфора из удобрений. Разница заключалась лишь в том, что количество фосфора, взятого растениями из удобрения, определялось ¡не по разности между содержанием фосфора в контрольных и опытных растениях, а путем прямого измерения количества меченого фосфора, поступившего в растение из удобрения. Параллельно проводившиеся химические анализы растений на содержание фосфора в этих опытах давали возможность определить, какая доля от общего содержания фосфора в растении приходилась на фосфор удобрения (меченый) и фосфор, взятый из почвы (немеченый).
