Zastosowanie metody elektronowego rezonansu paramagnetycznego w badaniach olejów i rozproszonej materii organicznej. Elektroniczny rezonans paramagnetyczny. Metoda EPR. Zastosowania Rezonans elektroniczny
EPR
Zasada metody EPR
Historia odkrycia metody EPR
Metoda EPR jest główną metodą badania cząstek paramagnetycznych obecnych w układach biologicznych. Cząstki paramagnetyczne o dużym znaczeniu biologicznym obejmują dwa główne typy związków - są towolne rodniki oraz metale o zmiennej wartościowości (Jak na przykład Fe, Cu, Co, Ni, Mn) lub ich kompleksy. Oprócz stanów wolnorodnikowych metoda EPR jest wykorzystywana do badania stanów tripletowych powstających w trakcie procesów fotobiologicznych.
Metoda elektronowego rezonansu paramagnetycznego została odkryta stosunkowo niedawno - in 1944 . na Uniwersytecie Kazańskim Evgeny Konstantinovich ZAVOYSKY w badaniu absorpcji energii elektromagnetycznej przez paramagnetyczne sole metali. Zauważył, że pojedynczy kryształ CuCl 2, umieszczony w stałym polu magnetycznym 40 Gauss (4 mT) zaczyna absorbować promieniowanie mikrofalowe o częstotliwości około 133 MHz.
Pionierami zastosowania EPR w badaniach biologicznych w ZSRR byli L.A. Blumenfeld i A.E. Kalmanson, który w 1958 roku opublikował artykuł w czasopiśmie Biophysics na temat badań nad wolnymi rodnikami wytwarzanymi w wyniku działania promieniowania jonizującego na białka.
Momenty mechaniczne i magnetyczne elektronu
Ruch orbitalny i spinowy elektronów leży u podstaw ich orbitalnych i spinowych momentów mechanicznych. Orbitalny moment pędu elektronu R po orbicie o promieniu R równa się:
Gdzie I jest prądem w obwodzie i S - obszar konturu (w tym przypadku orbita kołowa jest równa pR2 ). Podstawiając we wzorze (2) wyrażenie określające powierzchnię i biorąc pod uwagę, że:
Porównując wyrażenia na momenty mechaniczne i magnetyczne elektronu (1) i (4) możemy napisać, że:
Gdzie n - orbitalna liczba kwantowa, która przyjmuje wartości 0, 1, 2 oraz m W tym przypadku, biorąc pod uwagę (6), wyrażenie na magnetyczny moment orbitalny będzie wyglądać tak:
Spinowy moment magnetyczny elektronu jest związany z ruchem spinowym elektronu, który można przedstawić jako ruch wokół własnej osi. Spinowy moment mechaniczny elektronu jest równy:
|
|
Gdzie S - spinowa liczba kwantowa równa 1/2 .
Magnetyczne i mechaniczne momenty spinowe są powiązane zależnością:
|
| (10) |
Gdzie SM
- magnetyczna liczba kwantowa równa +1/2
. Stosunek momentu magnetycznego do momentu mechanicznego nazywany jest stosunkiem żyromagnetycznym ( g
). Widać, że dla ruchu orbitalnego: 
, a do spinu: 
Dla stosunku żyromagnetycznego elektronów o różnym udziale ruchu orbitalnego i spinowego wprowadza się współczynnik proporcjonalności g
tak, że:
|
| (11) |
Ten współczynnik proporcjonalności nazywa się g -czynnik. g =1, w S =0, tj. gdy nie ma ruchu spinowego elektronu i istnieje tylko ruch orbitalny, oraz g =2 jeśli nie ma ruchu orbitalnego i istnieje tylko ruch spinowy (na przykład dla swobodnego elektronu).
Moment magnetyczny elektronu generalnie składa się zspin i orbitalmomenty magnetyczne. Jednak w większości przypadków orbitalny moment magnetyczny wynosi zero. Dlatego, omawiając zasadę metody ýïr, tylkospinowy moment magnetyczny.
Efekt Zeemana
Energia oddziaływania momentu magnetycznego elektronu z polem magnetycznym wyraża się równaniem:
| (12) |
Gdzie m H - natężenie pola magnetycznego, cos( mH ) jest cosinusem kąta między m oraz H .
Efekt Zeemana (ryc. 1) ( ES =+1/2 oraz ES =-1/2 )
Z równania (11) wynika, że:
W tym przypadku różnica energii między dwoma poziomami będzie wynosić:
|
| (15) |
Równanie (14) opisuje efekt Zeemana, który można wyrazić następującymi słowami:poziomy energetyczne elektronów umieszczonych w polu magnetycznym rozpadają się w tym polu w zależności od wielkości spinowego momentu magnetycznego i natężenia pola magnetycznego.
Podstawowe równanie rezonansu
Liczba elektronów o określonej energii zostanie określona zgodnie z rozkładem Boltzmanna, a mianowicie:
Jeśli teraz energia elektromagnetyczna zostanie przyłożona do układu elektronów w polu magnetycznym, to przy pewnych wartościach energii padającego kwantu nastąpią przejścia elektronów między poziomami. Warunkiem koniecznym przejść jest równość energii kwantu padającego ( h ) różnica energii między poziomami elektronów o różnych spinach ( gbH ).
|
| (17) |
Równanie (17) wyraża główny warunek absorpcji energii przez elektrony. Pod wpływem promieniowania elektrony znajdujące się na wyższym poziomie energetycznym będą emitować energię i wracać na niższy poziom, zjawisko to nazywa sięemisja indukowana.
Elektrony na niższym poziomie pochłoną energię i przeniosą się na wyższy poziom energetyczny, zjawisko to nazywa sięabsorpcja rezonansowa. Ponieważ prawdopodobieństwa pojedynczych przejść między poziomami energii są równe, a całkowite prawdopodobieństwo przejścia jest proporcjonalne do liczby elektronów na danym poziomie energii, topochłanianie energii przeważa nad jej emisją . Wynika to z faktu, że jak wynika z równania (16), populacja poziomu dolnego jest wyższa niż populacja poziomu energetycznego górnego.
W tym miejscu należy zwrócić uwagę na szczególną pozycję wolnych rodników, tj. cząsteczki z niesparowanymi elektronami na zewnętrznym orbicie elektronów w rozkładzie elektronów na poziomach energetycznych. Jeśli orbital ma parę elektronów, to naturalnie populacja poziomów energetycznych będzie taka sama, a ilość energii pochłoniętej przez elektrony będzie równa ilości energii wyemitowanej.
Pochłanianie energii przez substancję umieszczoną w polu magnetycznym będzie zauważalne tylko wtedy, gdy na orbicie będzie tylko jeden elektron, wtedy będzie można mówić oDystrybucja Boltzmannaelektrony między poziomami energii.
Charakterystyka widm EPR
Amplituda sygnału
Aby określić stężenie, mierzy się pola pod krzywą absorpcji dla wzorca o znanym stężeniu centrów paramagnetycznych w mierzonej próbce i nieznanym stężeniu; znajduje się na podstawie proporcji, pod warunkiem, że obie próbki mają ten sam kształt i objętość:
|
| (18) |
Gdzie C obrót silnika. oraz C ten. - stężenie zmierzona próbka i wzorzec, odpowiednio, oraz S obrót silnika. oraz S ten. - powierzchnia pod liniami absorpcji mierzonego sygnału i wzorca.
Do wyznaczenia obszaru pod linią absorpcji nieznanego sygnału można wykorzystać metodę całkowania numerycznego:
Gdzie f(H) - pierwsza pochodnalinie absorpcyjne (widmo EPR), F(H) - funkcjonować linie absorpcyjne i H - napięcie pole magnetyczne.
Gdzie f"(H) jest pierwszą pochodną linii absorpcji, lub Widmo EPR . Łatwo jest przejść od całki do sumy interkalowej, biorąc pod uwagę, że H=n*DH otrzymujemy:
|
| (21) |
Gdzie D.H. jest etapem zmiany pola magnetycznego i n ja - numer kroku.
Zatem pole pod krzywą absorpcji będzie równe iloczynowi kwadratu kroku pola magnetycznego i sumy iloczynów amplitudy widma EPR i liczby kroku. Z wyrażenia (21) łatwo zauważyć, że dla dużych n (tj. daleko od środka sygnału) udział odległych części widma może być dość duży nawet przy małych wartościach amplitudy sygnału.
Kształt linii
Chociaż zgodnie z podstawowym równaniem rezonansowym absorpcja zachodzi tylko wtedy, gdy energia padającego kwantu jest równa różnicy energii między poziomami niesparowanych elektronów, widmo EPR nie jest linią, lecz ciągły w sąsiedztwie punktu rezonansowego. Funkcja opisująca sygnał EPR nazywa sięfunkcja kształtu linii . W rozcieńczonych roztworach, gdy można pominąć oddziaływanie między cząstkami paramagnetycznymi, krzywą absorpcji opisuje funkcja Lorentza:
Funkcja Gaussa to koperta Widmo EPR, jeśli zachodzi interakcja między cząstkami paramagnetycznymi. Szczególnie ważne jest uwzględnienie kształtu linii przy określaniu obszaru pod krzywą absorpcji. Jak widać ze wzorów (22) i (23) funkcja Lorentza ma wolniejszy spadek i odpowiednio szersze skrzydła, co może dawać znaczny błąd przy całkowaniu widma.
Szerokość linii
Szerokość widma EPR zależy od oddziaływania momentu magnetycznego elektronu z momentami magnetycznymi otaczających ją jąder(sieć) i elektrony.
Rozważmy bardziej szczegółowo mechanizm pochłaniania energii przez niesparowane elektrony. Jeśli w stanie niskiej energii występuje N 1 elektronów i w wysokiej energii N 2 i N jeszcze 1 N 2, to gdy do próbki zostanie przyłożona energia elektromagnetyczna, różnica w populacjach poziomów będzie się zmniejszać, aż stanie się równa zeru.
Dzieje się tak, ponieważ prawdopodobieństwa pojedynczego przejścia pod działaniem promieniowania ze stanu niskoenergetycznego do stanu wysokoenergetycznego i odwrotnie ( W 12 i W 21) są sobie równe, a populacja niższego poziomu jest wyższa. Wprowadźmy zmienną n =N 1 -N 2. Następnie można zapisać zmianę różnicy poziomów populacji w czasie:
oraz 
; gdzie
| (24) |
Jednak w eksperymencie nie obserwuje się zmiany różnicy poziomów populacji ze względu na fakt, że zachodzą procesy relaksacji, które utrzymują tę różnicę na stałym poziomie. Mechanizm relaksacji polega na przeniesieniu kwantu energii elektromagnetycznej do sieci lub otaczających ją elektronów i przywróceniu elektronu do poziomu niskoenergetycznego
Jeśli oznaczymy prawdopodobieństwa przejść indukowanych przez sieć jako P 12 i P 21 i P 12 mniej P 21 , to zmiana poziomu różnicy populacji będzie wynosić:
W stanie stacjonarnym, gdy zmiana różnicy populacji wynosi zero, początkowa różnica w poziomie populacji ( n 0) pozostaje stałe i równe:
Lub zastąpienie P 12 +P 21 dnia 1/T 1 , otrzymujemy
|
| (29) |
Wartość T 1 zadzwoniłczas relaksacji spinowo-siatoweji charakteryzuje średni czas życia stanu wirowania. W rezultacie zmianę różnicy populacji pomiędzy poziomami układu niesparowanych elektronów, który znajduje się pod wpływem promieniowania elektromagnetycznego i oddziałuje z siecią, określi równanie:
I w 2WT 1 dużo mniej 1 , n = n 0 , czyli przy stosunkowo niskich mocach różnica poziomów populacji pozostaje praktycznie stały . Z relacji niepewności Heisenberga wynika, że:
|
| (32) |
Jeśli to zaakceptujemy Dt równa się T 1 i DE odpowiada gbDH , to równanie (32) można przepisać jako:
|
| (33) |
Tych. niepewność szerokości linii jest odwrotnie proporcjonalna do czasu relaksacji spin-sieć.
Oprócz oddziaływania momentu magnetycznego niesparowanego elektronu z siecią, możliwe jest również jego oddziaływanie z momentami magnetycznymi innych elektronów. Ta interakcja prowadzi do skrócenia czasu relaksacji, a tym samym do poszerzenia linii w widmie EPR. W tym przypadku wprowadzono pojęcie czasu relaksacji spinowo-spinowej ( T 2). Zaobserwowany czas relaksacji uważa się za sumę czasów relaksacji spin-sieć i spin-spin.
Na wolne rodniki w roztworach T 1 dużo mniej T 2, więc szerokość linii zostanie określona przez T 2. Wśród mechanizmów poszerzania linii należy wymienić:oddziaływanie dipol-dipol; anizotropia czynnika g; dynamiczne poszerzanie linii i wymiana spinów .
Oddziaływanie dipol-dipol opiera się na oddziaływaniu momentu magnetycznego niesparowanego elektronu z lokalnym polem magnetycznym wytworzonym przez sąsiednie elektrony i jądra. Siła pola magnetycznego w dowolnym punkcie zależy od odległości do tego punktu i wzajemnej orientacji momentów magnetycznych niesparowanego elektronu i innego oddziałującego elektronu lub jądra. Zmiana energii niesparowanego elektronu zostanie określona przez:
| (34) |
Gdzie m jest momentem magnetycznym elektronu, R - odległość od źródła lokalnego pola magnetycznego, q jest kątem między oddziałującymi momentami magnetycznymi.
Wkład anizotropii g -czynnik poszerzenia linii EPR wynika z faktu, że ruch orbitalny elektronu wytwarza przemienne pole magnetyczne, z którym oddziałuje spinowy moment magnetyczny. Ta interakcja prowadzi do odchyleń g -współczynnik wartości 2,0023 odpowiedniwolny elektron.
Dla próbek krystalicznych wartości g -współczynnik odpowiadający orientacji kryształu oznacza g XX, g yy i g zz odpowiednio. Gdy cząsteczki poruszają się szybko, na przykład w roztworach, anizotropia g -współczynnik może być uśredniony.
Poszerzenie sygnału EPR może wynikać z wzajemnej przemiany dwóch form radykału. Jeśli więc każda z form radykału ma własne spektrum EPR, to wzrost tempa wzajemnego przekształcania się tych form w siebie doprowadzi do poszerzenia linii, ponieważ w tym przypadku skraca się czas życia rodnika w każdym stanie. Ta zmiana szerokości sygnału nazywa siędynamiczne poszerzenie sygnału. Wymiana spinów to kolejny sposób na poszerzenie sygnału EPR. Mechanizm rozszerzania się sygnału podczas wymiany spinowej polega na zmianie kierunku spinowego momentu magnetycznego elektronu na przeciwny, gdy zderza się on z innym niesparowanym elektronem lub innym paramagnesem.
Ponieważ taka kolizja skraca czas życia elektronu w danym stanie, sygnał EPR ulega poszerzeniu. Najczęstszym przypadkiem poszerzenia linii EPR przez mechanizm wymiany spinu jest poszerzenie sygnału w obecności tlenu lub jonów metali paramagnetycznych.
Struktura nadsubtelna
Podział linii EPR na kilka opiera się na zjawisku oddziaływania nadsubtelnego, czyli oddziaływania momentów magnetycznych niesparowanych elektronów ( M S) z momentami magnetycznymi jąder ( M N).
|
| Ponieważ w obecności momentu magnetycznego jądra całkowity moment magnetyczny jest równy M S+ M N , gdzie M S jest momentem magnetycznym elektronu, a M N to moment magnetyczny jądra, to całkowite pole magnetyczne H kwoty. = H 0 ± H lok. , gdzie H lok. - lokalne pole magnetyczne wytworzone przez moment magnetyczny jądra. |
Ważną cechą interakcji nadsubtelnej są zasady selekcji przejść między poziomami. Dozwolone przejścia to przejścia, w których zmiana spinowego momentu magnetycznego niesparowanego elektronu ( DM S) równa się 1 , oraz spinowy moment magnetyczny jądra ( DM N) równa się 0 .
W rozważanym przez nas przykładzie spin jądra oddziałującego z niesparowanym elektronem był liczbą połówkową i był równy ± 1/2, co ostatecznie dało nam podział na dwie linijki. Ten spin jest typowy dla protony . W jądrach atomów azotu ( N 14) obrót liczb całkowitych. Może przyjmować wartości ±1 oraz 0 . W tym przypadku, gdy niesparowany elektron oddziałuje z jądrem atomu azotu, nastąpi rozszczepienie na trzy identyczne linie, odpowiadające wartości spinu +1 , -1 oraz 0 . W ogólnym przypadku liczba linii w widmie EPR jest równa 2M N+ 1 .
Oczywiście liczba niesparowanych elektronów i odpowiednio pole pod krzywą absorpcji EPR nie zależą od wielkości spinu jądrowego i są wartościami stałymi. Dlatego przy dzieleniu pojedynczego sygnału EPR na dwa lub trzy, intensywność każdego składnika będzie odpowiednio in 2 lub 3 razy niższy.
Bardzo podobny obraz powstaje, gdy niesparowany elektron oddziałuje nie z jednym, ale z kilkoma równoważnymi (o tej samej stałej interakcji nadsubtelnej) jądrami, które mają moment magnetyczny inny niż zero, na przykład dwa protony. W tym przypadku powstają trzy stany odpowiadające orientacji spinów protonów:
1. zarówno na boisku,
2. obaj na boisku
3. jeden na boisku i jeden na boisku.
Opcja 3 jest dwa razy bardziej prawdopodobne niż 1 lub 2 , dlatego można to zrobić na dwa sposoby. W wyniku takiego rozkładu niesparowanych elektronów pojedyncza linia dzieli się na trzy linie o współczynniku natężenia 1:2:1 . Ogólnie rzecz biorąc, dla n równoważne jądra o spinie M N liczba wierszy to 2nM N+ 1 .
Urządzenie do radiowego spektrometru EPR
Urządzenie radiospektrometru EPR pod wieloma względami przypomina urządzenie spektrofotometru do pomiaru absorpcji optycznej w zakresie widzialnym i ultrafioletowym widma.
Źródłem promieniowania w radiospektrometrze jest klistron, czyli lampa radiowa dająca promieniowanie monochromatyczne w zakresie fal centymetrowych. Apertura spektrofotometru w radiospektrometrze odpowiada tłumikowi, który pozwala dozować moc padającą na próbkę. Kuweta z próbką w radiospektrometrze znajduje się w specjalnej jednostce zwanej rezonatorem. Rezonator jest równoległościanem z cylindryczną lub prostokątną wnęką, w której znajduje się absorbująca próbka. Wymiary rezonatora są takie, że powstaje w nim fala stojąca. Brakującym elementem w spektrometrze optycznym jest elektromagnes, który wytwarza stałe pole magnetyczne niezbędne do rozdzielenia poziomów energetycznych elektronów.
Promieniowanie, które przeszło przez mierzoną próbkę, w spektrometrze radiowym i spektrofotometrze, trafia na detektor, następnie sygnał detektora jest wzmacniany i rejestrowany na rejestratorze lub komputerze. Należy zwrócić uwagę na jeszcze jedną różnicę radiospektrometru. Polega ona na tym, że promieniowanie o zasięgu radiowym jest przekazywane ze źródła do próbki, a następnie do detektora za pomocą specjalnych prostokątnych rurek zwanych falowodami. Wymiary przekrojów falowodów są określone przez długość fali transmitowanego promieniowania. Ta cecha transmisji emisji radiowej przez falowody decyduje o tym, że do rejestracji widma EPR w spektrometrze radiowym wykorzystywana jest stała częstotliwość promieniowania, a stan rezonansu uzyskuje się poprzez zmianę wielkości pola magnetycznego.
Inną ważną cechą spektrometru radiowego jest wzmacnianie sygnału poprzez jego modulację przez zmienne pole o wysokiej częstotliwości. W wyniku modulacji sygnału jest on różnicowany, a linia absorpcji zamieniana na swoją pierwszą pochodną, którą jest sygnał EPR.
Sygnały EPR obserwowane w układach biologicznych
Zastosowanie metody EPR w badaniach biologicznych wiąże się z badaniem dwóch głównych typów centrów paramagnetycznych - wolnych rodników i jonów metali o zmiennej wartościowości. Badanie wolnych rodników w układach biologicznych wiąże się z trudnością, która polega na niskim stężeniu wolnych rodników powstających podczas życiowej aktywności komórek. Stężenie rodników w komórkach normalnie metabolizujących według różnych źródeł wynosi około 10 -8 - 10 -10 mln , a nowoczesne radiospektrometry umożliwiają pomiar stężeń rodników 10 -6 - 10 -7 mln .
Możesz zwiększyć stężenie wolnych rodników spowalniając ich śmierć i zwiększając tempo ich powstawania. Można tego dokonać poprzez napromieniowanie (UV lub promieniowaniem jonizującym) obiektów biologicznych w niskich temperaturach.
Badanie struktury rodników mniej lub bardziej złożonych biologicznie ważnych cząsteczek było jednym z pierwszych obszarów zastosowania metody EPR w badaniach biologicznych.
Widma EPR cysteiny napromieniowanej promieniowaniem UV
Widmo EPR wątroby szczura
Kolejnym ważnym obszarem zastosowania metody EPR w badaniach biologicznych było badanie metali o zmiennej wartościowości i/lub ich kompleksów, które istniejąin vivo.
Jeśli spojrzysz na widmo EPR, na przykład wątroby szczura, możesz zobaczyć sygnały cytochromu R-450 mający g -czynnik 1,94 oraz 2,25 , sygnał methemoglobiny z g -czynnik 4,3 oraz sygnał wolnorodnikowy należący do rodników semichinonowych kwasu askorbinowego i flawin z g -czynnik 2,00 .
Ze względu na krótkie czasy relaksacji sygnały EPR metaloprotein można zaobserwować tylko w niskich temperaturach, takich jak ciekły azot.
Jednak sygnały EPR niektórych rodników można również zaobserwować w temperaturze pokojowej. Sygnały te obejmują sygnały EPR wielu rodników semichinonowych lub fenoksylowych, takich jak rodnik semichinonowy ubichinonu, rodnik fenoksylowy i semichinonowy a-tokoferolu (witaminy). mi), witamina A D, i wiele innych.
ELEKTRONICZNY REZONANS PARAMAGNETYCZNY (EPR)- rezonansowa absorpcja fal elektromagnetycznych przez substancje zawierające cząstki paramagnetyczne. Metody oparte na EPR znalazły szerokie zastosowanie w praktyce laboratoryjnej. Z ich pomocą badają kinetykę reakcji chemicznych i biochemicznych (patrz Kinetyka procesów biologicznych, Kinetyka chemiczna), rolę wolnych rodników w procesach życiowych organizmu w warunkach normalnych i patologicznych (patrz Wolne rodniki), mechanizmy występowanie i przepływ procesów fotobiologicznych (patrz Fotobiologia) itp.
Zjawisko EPR odkrył radziecki naukowiec B.K. Zavoisky w 1944 roku. Elektronowy rezonans paramagnetyczny jest charakterystyczny tylko dla cząstek paramagnetycznych, to znaczy cząstek, które mogą być namagnesowane po przyłożeniu do nich pola magnetycznego) z nieskompensowanym elektronicznym momentem magnetycznym, który z kolei wynika z własnego momentu mechanicznego elektronu - spinu. Elektrony mają szczególny rodzaj ruchu wewnętrznego, który można porównać z obrotem czubka wokół własnej osi. Związany z nim moment pędu nazywa się spinem. Ze względu na spin elektron ma stały moment magnetyczny skierowany przeciwnie do spinu. W większości cząsteczek elektrony są ułożone w orbitale w taki sposób, że ich spiny są skierowane przeciwnie, momenty magnetyczne są kompensowane, a sygnał EPR z nich nie może być obserwowany. Jeśli pole magnetyczne elektronu nie jest kompensowane przez spin innego elektronu (czyli cząsteczka zawiera niesparowane elektrony), rejestrowany jest sygnał EPR. Cząstki z niesparowanymi elektronami to wolne rodniki, jony wielu metali (żelaza, miedzi, manganu, kobaltu, niklu itp.), szereg wolnych atomów (wodór, azot, metale alkaliczne itp.).
W przypadku braku zewnętrznego pola magnetycznego kierunek (orientacja) momentu magnetycznego elektronu w przestrzeni może być dowolny; energia takiego elektronu nie zależy od orientacji jego momentu magnetycznego. Zgodnie z prawami mechaniki kwantowej, w zewnętrznym polu magnetycznym orientacja momentu magnetycznego elektronu nie może być dowolna - może być skierowana albo w kierunku pola magnetycznego, albo przeciwnie do niego.
Zgodnie z orientacją momentu magnetycznego elektronu, jego energia w polu magnetycznym również może przyjmować tylko dwie wartości: minimalną E1 - gdy moment magnetyczny jest zorientowany "wzdłuż pola" i maksymalną E2 - gdy jest zorientowany „przeciwko polu”, a różnicę energii tych stanów (delta E ) oblicza się ze wzoru: ΔE = gβH, gdzie β to magneton Bohra (jednostka miary momentu magnetycznego elektronu), H to siła pola magnetycznego, g jest stałą zależną od struktury elektronowej cząstki paramagnetycznej. Jeżeli na układ niesparowanych elektronów w zewnętrznym polu magnetycznym wpływa promieniowanie elektromagnetyczne, którego energia kwantowa jest równa ΔE, to pod wpływem promieniowania elektrony zaczną przechodzić ze stanu o niższej energii do stanu o wyższą energię, której towarzyszyć będzie absorpcja promieniowania przez substancję.
EPR nazywa się metodami spektroskopii radiowej, ponieważ do obserwacji elektronowego rezonansu paramagnetycznego wykorzystuje się promieniowanie w zakresie częstotliwości radiowych fal elektromagnetycznych.
EPR rejestruje się za pomocą specjalnych przyrządów - spektrometrów radiowych. Należą do nich: elektromagnes, źródło promieniowania o częstotliwości radiowej, linia transmisji promieniowania od źródła do próbki (falowód), rezonator, w którym znajduje się badana próbka, układy do wykrywania, wzmacniania i rejestracji sygnału. Najpopularniejsze spektrometry radiowe wykorzystujące promieniowanie elektromagnetyczne o długości fali 3,2 cm lub 8 mm.
Rejestracja sygnału EPR odbywa się w następujący sposób. Intensywność pola magnetycznego wytworzonego przez elektromagnes zmienia się liniowo w pewnych granicach. Przy wartościach napięcia odpowiadających warunkom rezonansu próbka pochłania energię promieniowania elektromagnetycznego. Linia absorpcji (sygnał EPR) to zależność mocy promieniowania zaabsorbowanego przez próbkę od natężenia pola magnetycznego. W istniejących spektrometrach radiowych sygnał EPR jest rejestrowany jako pierwsza pochodna linii absorpcji.
Do opisu i analizy widm EPR wykorzystuje się szereg parametrów charakteryzujących natężenie linii, ich szerokość, kształt oraz położenie w polu magnetycznym. Intensywność linii EPR, poza innymi czynnikami równymi, jest proporcjonalna do koncentracji cząstek paramagnetycznych, co umożliwia przeprowadzenie analizy ilościowej.
Rozważając zjawisko EPR, należy wziąć pod uwagę, że moment magnetyczny niesparowanego elektronu oddziałuje nie tylko z polem magnetycznym elektromagnesu, ale także z polami magnetycznymi wytwarzanymi przez otoczenie elektronu: inne niesparowane elektrony, jądra magnetyczne (patrz Magnetyczny rezonans jądrowy). Oddziaływanie niesparowanych elektronów z jądrami często prowadzi do podziału widma EPR na kilka linii. Analiza takich widm umożliwia identyfikację natury cząstek paramagnetycznych oraz ocenę charakteru i stopnia ich wzajemnego oddziaływania.
Na kształt widma EPR wpływa również udział cząstek paramagnetycznych w reakcjach chemicznych, ruchu cząsteczek i innych efektach kinetycznych. Dlatego EPR służy do wykrywania, ilościowego określania i identyfikacji cząstek paramagnetycznych, badania kinetyki reakcji chemicznych i biochemicznych oraz dynamiki molekularnej.
Ze względu na swoją wszechstronność EPR znajduje szerokie zastosowanie w różnych dziedzinach nauki. Zastosowanie EPR w biologii i medycynie wynika z obecności w komórkach, tkankach i biol. płyny różnych ośrodków paramagnetycznych w przyrodzie. Za pomocą EPR stwierdzono obecność wolnych rodników w prawie wszystkich tkankach zwierzęcych i roślinnych. Źródłem wolnych rodników są związki takie jak flawiny, koenzym Q i inne substancje pełniące rolę nośników elektronów w reakcjach metabolizmu energetycznego w komórkach roślinnych i zwierzęcych; centra paramagnetyczne występujące w izolowanych tkankach należą głównie do łańcuchów transportu elektronów mitochondriów, mikrosomów, chloroplastów (patrz Oddychanie). Stwierdzono, że zawartość wolnych rodników w tkankach koreluje z ich aktywnością metaboliczną. Liczne prace pokazują zmianę liczby wolnych rodników w różnych stanach patologicznych, na przykład podczas onkogenezy (patrz), rozwoju uszkodzenia popromiennego (patrz), zatrucia (patrz Zatrucie), co tłumaczy się naruszeniem metabolizmu energetycznego w patologia (patrz Bioenergetyka).
Za pomocą EPR w tkankach zwierząt i roślin określa się jony paramagnetyczne (żelazo, miedź, mangan, kobalt itp.), które są częścią metaloprotein biorących udział w reakcjach przeniesienia elektronów wzdłuż łańcuchów transportu elektronów i katalizie enzymatycznej jak w pigmentach przenoszących tlen (hemoglobina). Za pomocą EPR można badać przemiany redoks jonów metali i charakter oddziaływania jonów z ich otoczeniem, co umożliwia ustalenie drobnej struktury kompleksów zawierających metal.
Zmiany patologiczne w tkankach prowadzą do zmian sygnałów EPR metaloprotein, co jest związane z rozpadem paramagnetycznych kompleksów metali, zmianami w środowisku jonów paramagnetycznych i przejściem jonów do innych kompleksów. Jednak badanie natury centrów paramagnetycznych tkanek, zwłaszcza wolnych rodników, wiąże się z pewnymi trudnościami ze względu na złożoność rozszyfrowania widm EPR.
Za pomocą EPR udało się zbadać mechanizmy reakcji enzymatycznych (patrz Enzymy). W szczególności możliwe jest jednoczesne badanie zarówno kinetyki powstawania i zużycia wolnych rodników podczas reakcji enzymatycznych, jak i kinetyki przemian redoks metali wchodzących w skład enzymów, co umożliwia ustalenie kolejności etapów procesu enzymatycznego. reakcja.
Zastosowanie EPR w badaniu uszkodzeń popromiennych w biol. obiektów umożliwia uzyskanie informacji o naturze rodników powstających w biopolimerach, o mechanizmach i kinetyce reakcji rodnikowych, które rozwijają się w napromieniowanych obiektach i prowadzą do efektu biologicznego. Metodę EPR można zastosować w dozymetrii awaryjnej np. w przypadku przypadkowego narażenia ludzi do oceny dawki ekspozycyjnej, wykorzystując do tego obiekty ze strefy ekspozycji.
Ważne miejsce zajmuje EPR w badaniu procesów fotobiologicznych z udziałem wolnych rodników (patrz Molekuła, Wolne rodniki, Fotobiologia, Fotouczulanie). EPR służy do szczegółowego badania powstawania wolnych rodników w białkach, kwasach nukleinowych i ich składnikach pod wpływem promieniowania ultrafioletowego oraz roli tych rodników w fotodegradacji biopolimerów (patrz Światło). Zastosowanie EPR dostarczyło ważnych informacji o podstawowych mechanizmach fotosyntezy (patrz). Wykazano, że pierwotną reakcją fotosyntezy jest przeniesienie elektronu z wzbudzonej światłem cząsteczki chlorofilu i utworzenie kationu rodnika chlorofilu. Zidentyfikowano również charakter cząsteczek, które przyjmują elektron oddany przez wzbudzoną cząsteczkę chlorofilu.
EPR służy również do badania struktury biologicznie ważnych makrocząsteczek i biomembran. Na przykład jony żelaza, które są częścią hemu w białkach zawierających hem, mogą być w stanie wysokospinowym (elektrony na orbitach zewnętrznych nie są sparowane, całkowity spin jest maksymalny) i niskospinowym (elektrony zewnętrzne są w pełni lub częściowo sparowane wirowanie jest minimalne). Badania cech sygnałów EPR stanów wysokospinowych i niskospinowych jonów żelaza w hemoglobinie i jej pochodnych przyczyniły się do zrozumienia przestrzennej struktury cząsteczki hemoglobiny.
Znaczące postępy w badaniach struktury biomembran i biopolimerów osiągnięto po pojawieniu się sondy spinowej i metod znakowania (patrz Membrany biologiczne). Jako znaczniki spinowe i sondy stosowane są głównie stabilne rodniki nitroksylowe (patrz Wolne rodniki). Rodnik nitroksylowy może być kowalencyjnie związany z cząsteczkami (spin label) lub zatrzymywany w badanym układzie dzięki oddziaływaniom fizycznym (spin probe). Istota tkwi w tym, że kształt widma EPR rodników nitroksydowych zależy od właściwości mikrośrodowiska: lepkości, charakteru i ruchu molekularnego, lokalnych pól magnetycznych itp. Wskaźnikiem są ślady spinowe związane kowalencyjnie z różnymi grupami biopolimerów. stanu struktury biopolimeru. Za pomocą znaczników spinowych bada się przestrzenną strukturę biopolimerów, zmiany strukturalne w białkach podczas denaturacji, tworzenie kompleksów enzym-substrat, antygen-przeciwciało itp.
Metoda sond spinowych służy do badania sposobów upakowania i ruchliwości lipidów w biobłonach, oddziaływań lipidowo-białkowych, przemian strukturalnych w błonach wywołanych działaniem różnych substancji itp. Na podstawie badań znaczników spinowych i sond, metody oznaczania leków w biol. płyny, a także kwestie ukierunkowanego transportu leków itp.
Tak więc za pomocą EPR pokazano szeroką dystrybucję procesów elektronicznych w ciele w normie i w przypadku jakiejkolwiek patologii. Stworzenie teorii i udoskonalenie technologii metody EPR stanowiło podstawę elektroniki kwantowej jako gałęzi nauki, doprowadziło do powstania molekularnych generatorów i wzmacniaczy fal radiowych (maserów) i światła - laserów (patrz), które są szeroko stosowane w wielu dziedzinach gospodarki narodowej.
Blumenfeld L. A., Voevodsky V. V. i Semenov A. G. Zastosowanie elektronowego rezonansu paramagnetycznego w chemii, Nowosybirsk, 1962, bibliogr.; Wertz J. i Bolton J. Teoria i praktyczne zastosowania metody EPR, przeł. z ang. M., 1975, bibliogr.; Ingram D. Elektronowy rezonans paramagnetyczny w biologii, tłum. z angielskiego M., 1972; Kalmanson A. E. Zastosowanie metody elektronowego rezonansu paramagnetycznego w biochemii, w książce: Usp. biol. chem., wyd. B. N. Stepanenko, t. 5, s. 289, M., 1963; Kuzniecow A. N. Metoda sondy spinowej. M., 1976; Liechtenstein GI. Metoda znaczników spinowych w biologii molekularnej, M., 1974; Metoda etykiety spinowej, wyd. L. Berliner, przeł. z angielskiego, M., 1979; Wolne rodniki w biologii, wyd. W. Pryor, przeł. z angielskiego, t. 1, s. 88, 178, M., 1979.
KN Timofiejew.
Widma EPR mogą służyć do wyznaczania wartościowości jonu paramagnetycznego i symetrii jego otoczenia, co w połączeniu z danymi rentgenowskiej analizy strukturalnej umożliwia wyznaczenie położenia jonu paramagnetycznego w sieci krystalicznej. Wartość poziomów energetycznych jonu paramagnetycznego umożliwia porównanie wyników EPR z danymi widm optycznych oraz obliczenie podatności magnetycznych paramagnetyków.
Metoda EPR umożliwia określenie charakteru i lokalizacji defektów sieci, takich jak centra barwne. W metalach i półprzewodnikach możliwa jest również EPR, związana ze zmianą orientacji spinów elektronów przewodzących. Metoda EPR znajduje szerokie zastosowanie w chemii i biologii, gdzie w trakcie reakcji chemicznych lub pod działaniem promieniowania jonizującego mogą powstawać cząsteczki z niewypełnionym wiązaniem chemicznym, wolne rodniki. Ich współczynnik g jest zwykle zbliżony do , a szerokość linii EPR 
mały. Ze względu na te właściwości, jeden z najbardziej stabilnych wolnych rodników (), który ma g = 2,0036, jest używany jako standard w pomiarach ESR. W biologii EPR badane są enzymy i wolne rodniki w układach biologicznych oraz związki metaloorganiczne.
EPR w silnych polach magnetycznych
Zdecydowana większość badań eksperymentalnych rezonansu paramagnetycznego została przeprowadzona w polach magnetycznych o natężeniu poniżej 20 ke. Tymczasem zastosowanie silniejszych pól statycznych i pól przemiennych o wyższych częstotliwościach znacznie rozszerzyłoby możliwości metody EPR i zwiększyłoby dostarczaną przez nią informację. W niedalekiej przyszłości stałe pola magnetyczne do 250 ke i pola impulsowe mierzone w dziesiątkach milionów erstedów. Oznacza to, że podziały Zeemana w stałych polach osiągną około 25 
, a w polach pulsacyjnych wartości są o dwa rzędy wielkości większe. Niski, używając spektrometru z magnesem nadprzewodzącym, zmierzył EPR w polach H0
65
ke. Prochorow i jego koledzy obserwowali sygnały EPR na długości fali 
=1,21mm.
Silne pola magnetyczne powinny być bardzo korzystne dla emisji jonów metali ziem rzadkich w kryształach, których odstępy między podpoziomami Starka są rzędu 10-100 
. Efekt EPR w zwykłych polach jest często nieobecny, ponieważ poziom naziemny Starka okazuje się być singletem lub ponieważ przejścia między podpoziomami Zeemana dubletu naziemnego Kramersa są zabronione. Ogólnie rzecz biorąc, możliwy jest efekt przejścia między różnymi podpoziomami Starka. Co więcej, pole kryształów w kryształach ziem rzadkich charakteryzuje się dużą liczbą parametrów, które pozwalają określić jaką wiedzę g- Tensor głównego dubletu Kramersa to za mało.
Silne pola magnetyczne mogą być również wykorzystywane do badania jonów z grupy żelaza, w szczególności takich jak 
które mają podziały rzędu 10 
100
.
W przypadku zastosowania do par sprzężonych wymiennych, umożliwiają to silne pola magnetyczne, obserwując efekt przejścia między poziomami o różnych wartościach wypadkowego spinu S pary z dokładnością spektroskopową mierzą parametr interakcji wymiennej J.
Rezonans paramagnetyczny w silnych polach magnetycznych będzie miał szereg cech. Efekty nasycenia magnetyzacji wystąpią w stosunkowo wysokich temperaturach. W niezbyt niskich temperaturach polaryzacja jonowych momentów magnetycznych będzie tak silna, że oprócz zewnętrznego pola magnetycznego konieczne będzie wprowadzenie do warunków rezonansowych pola wewnętrznego. Pojawi się zależność warunków rezonansowych od kształtu próbki.
Metoda EPR zyskała duże znaczenie w chemii, fizyce, biologii i medycynie, ponieważ pozwala określić struktury i stężenia wolnych rodników organicznych i nieorganicznych. Wolne rodniki mogą powstawać chemicznie, fotochemicznie lub przez promieniowanie o wysokiej energii.
Widmo EPR jest nadawane przez wolne rodniki, cząsteczki o nieparzystej liczbie elektronów, stany tripletowe cząsteczek organicznych, jony paramagnetycznych metali przejściowych i ich kompleksy.
Metodę EPR zaczęto wykorzystywać w badaniach biologicznych w latach 50. XX wieku. Ze względu na dość dużą czułość i możliwość określenia natury cząstek paramagnetycznych metoda ta znalazła szerokie zastosowanie w badaniu szeregu procesów biologicznych.
Oprócz sygnałów wolnorodnikowych w tkankach obserwuje się szereg sygnałów metalicznych (Fe, Cu, Mn, Ni, Co). Metale te są częścią metaloprotein biorących udział w wielu procesach enzymatycznych. Białka zawierające żelazo (cytochromy, ferredoksyny) są składnikami łańcuchów transportu elektronów w mitochondriach i chloroplastach.
Metodą EPR zbadano szereg układów enzymatycznych i znaleziono produkty wolnorodnikowe substratów. W wielu przypadkach udało się zaobserwować przemiany redoks jonów metali zawartych w centrum aktywnym enzymu.
Spektroskopia EPR jest szeroko stosowana w badaniach fotosyntezy: badany jest mechanizm pierwotnych etapów separacji ładunków w centrach reakcyjnych i dalszego przenoszenia elektronu wzdłuż łańcucha transportu elektronów.
Oprócz badania mechanizmów reakcji zachodzących z udziałem cząstek paramagnetycznych, metoda EPR jest również szeroko stosowana do badania właściwości strukturalnych i dynamicznych makrocząsteczek i biomembran.
Ostatnio do badania układów biologicznych i polimerowych często stosuje się metody „sondy paramagnetycznej”, „etykiet spinowych” i „pułapek spinowych”. Wszystkie opierają się na wykorzystaniu stabilnych rodników kwasu azotowego o różnej budowie, a raczej na analizie zmian szerokości linii widm EPR spowodowanych dyfuzją rotacyjną i translacyjną tych rodników.
Główną ideą metody spinowej znacznika i sondy jest przyłączenie wolnego rodnika do jednej lub drugiej grupy funkcjonalnej białka i zbadanie charakterystyki jego sygnałów EPR. Najwygodniejsze pod tym względem są rodniki nitroksylowe zawierające grupę wolnych rodników:
gdzie R1 i R2 to różne grupy chemiczne.
Metoda etykietowania wirowania polega na tym, że stabilny rodnik jest przyłączony do cząsteczki nieparamagnetycznej wiązaniem kowalencyjnym lub innym wiązaniem, tak że wolna wartościowość pozostaje nienaruszona. Charakter ruchu wyraźnie przejawia się w postaci widma i służy jako ważne źródło informacji o pierwotnej cząsteczce.
Jeśli cząsteczka jest zintegrowana z cząsteczką białka i jest tam utrzymywana przez siły elektrostatyczne lub oddziaływania hydrofobowe, wówczas taka cząsteczka nazywana jest sonda wirowa. Metoda opiera się na badaniu ruchliwości rotacyjnej i translacyjnej rodnika sondy w środowisku wodnym lub organicznym lub w matrycy polimerowej. Ruchliwość rodnika zależy od ruchliwości cząsteczek środowiska, dlatego rodnik jest rodzajem molekularnego sensora strukturalnej i dynamicznej informacji o lokalnym środowisku.
Kształt sygnału EPR wytwarzanego przez znacznik spinowy lub sondę zależy od mikrootoczenia rodnika nitroksylowego, a przede wszystkim od ruchliwości obrotowej grupy, w której jest on zawarty.
Główną wadą znaczników spinowych i sond jest to, że chociaż cząsteczki te są małe, gdy są zawarte w dwuwarstwie lipidowej, nieco zmieniają jej właściwości.
W sercu metody „pułapki wirowe” to reakcja nieparamagnetycznej cząsteczki (pułapki) specjalnie wprowadzonej do badanego układu z krótkożyciowym rodnikiem, w wyniku której powstaje stabilny rodnik. Zachowanie kinetyczne powstałego stabilnego rodnika i jego struktura dostarczają informacji o kinetyce i mechanizmie procesów zachodzących w badanym układzie.
Przedmiotem badań chemii z wykorzystaniem spektroskopii EPR są: 1) wolne rodniki w produktach pośrednich reakcji organicznych; 2) kinetyka reakcji; 3) chemia zjawisk powierzchniowych; 4) zniszczenia wynikające z napromieniowania; 5) polimeryzacja pod wpływem wolnych rodników; 6) wolne rodniki zamrożone w niskich temperaturach; 7) metale o zmiennej wartościowości i ich kompleksy.
Metoda EPR wnosi cenny wkład w badanie kinetyki i mechanizmów reakcji chemicznych. Po pierwsze, pomiary szerokości linii w widmach EPR można wykorzystać do wyznaczenia stałych szybkości procesów z udziałem cząstek paramagnetycznych, których charakterystyczny czas życia mieści się w zakresie 10 -5 -10 -10 s. Po drugie, metoda EPR umożliwia wykrywanie cząstek paramagnetycznych z dużą czułością w różnych warunkach, co dostarcza cennych informacji o mechanizmach reakcji. Po trzecie, spektrometr EPR może być wykorzystany jako urządzenie analityczne do wykrywania stężenia reagujących cząsteczek paramagnetycznych w toku reakcji. Liczba centrów paramagnetycznych w próbce jest proporcjonalna do obszaru pod widmem absorpcyjnym.
Metoda EPR jest szeroko stosowana do badania szybkich procesów związanych ze zmianami struktury molekularnej rodników. Procesy te obejmują utrudnioną rotację i przejścia konformacyjne.
W przypadku rodników o krótkim czasie życia czułość metody można zwiększyć, stosując system przepływowy lub napromienianie ciągłe. Widma EPR niestabilnych rodników można otrzymać przez utrwalanie ich w szkłach, matrycach zamrożonych gazów szlachetnych lub kryształach.
Pytania do rozmowy kwalifikacyjnej
1. Podstawy teoretyczne metody.
2. Parametry analityczne widma EPR.
3. Spektrometry EPR.
4. Zastosowanie EPR.
Zadania testowe
1. Stan rezonansu w metodzie EPR:
a) n= gH 0 (1-s) / 2p; b) δ \u003d (ΔH / H 0); c) hn \u003d gβH 0; d) δ = (Δν/ν 0)/(ΔН/Н 0).
2. Co dzieje się w momencie rezonansu w metodzie EPR:
a) kwanty promieniowania są absorbowane, nie dochodzi do reorientacji spinu;
b) kwanty promieniowania są absorbowane, a spiny są reorientowane, tj. przejście z niższego stanu energetycznego do wyższego i odwrotnie. Liczba przejść z dołu do góry jest większa niż liczba przejść z góry na dół.
c) kwanty promieniowania są absorbowane, a spiny są reorientowane, tj. przejście z niższego stanu energetycznego do wyższego i odwrotnie. Liczba przejść z góry na dół jest większa niż liczba przejść z dołu na górę.
3. Parametry widm EPR:
a) współczynnik g, szerokość pasma absorpcji, intensywność linii absorpcji;
b) całkowita liczba sygnałów, intensywność sygnału, przesunięcie chemiczne, krotność sygnału;
c) współczynnik g, szerokość pasma absorpcji, intensywność linii absorpcji, widma HFS EPR.
SPEKROMETRIA MASOWA
Ta metoda zasadniczo różni się od metod spektroskopowych. Metody spektrometrii masowej opierają się na jonizacji substancji, rozdzielaniu jonów, zgodnie ze stosunkiem ( m/z) oraz rejestrację masy powstałych fragmentów.
Teoretyczne i eksperymentalne podstawy spektrometrii mas położył D.D. Thomson, który po raz pierwszy w 1912 stworzył urządzenie do uzyskiwania widma mas jonów dodatnich. Jednak jego urządzenie miało niską rozdzielczość. Jego uczeń F. Aston w 1918 roku znacznie zwiększył rozdzielczość i po raz pierwszy odkrył na swoim urządzeniu izotopy pierwiastków. Niemal równocześnie z F. Astonem w Chicago A. Dempster skonstruował pierwszy spektrometr masowy, w którym za analizatorem służyło poprzeczne pole magnetyczne, a prądy jonowe mierzono metodami elektrycznymi. Jego schemat jest również stosowany w nowoczesnych urządzeniach.
Jonizację cząsteczek należy prowadzić w warunkach, w których powstały jon, niezależnie od metody jonizacji, nie ulegałby zderzeniom z innymi cząsteczkami lub jonami. Jest to konieczne do ustalenia związku między właściwościami jonu i cząsteczki.
Metody jonizacji
Jonizację można przeprowadzić różnymi metodami.
1. Metoda elektronowej jonizacji uderzeniowej (EI).
Jest to najczęstsza metoda otrzymywania jonów ze względu na prostotę i dostępność źródeł jonów oraz ich wysoką wydajność. Załóżmy, że przez opary substancji przechodzi strumień elektronów, których energia może być stopniowo zwiększana. Jeśli energia ta osiągnie pewien poziom, to kiedy elektron zderzy się z cząsteczką, elektron można „wybić” z niego, tworząc jon cząsteczkowy:
jon molekularny cząsteczki wieloatomowej (kation rodnikowy)
Najniższa energia bombardujących elektronów, przy której nazywa się tworzenie jonu z danej cząsteczki energia jonizacji materii. Energia jonizacji jest miarą siły, z jaką cząsteczka utrzymuje najmniej związany z nią elektron. Dla cząsteczek organicznych energia jonizacji wynosi 9 ÷ 12 eV.
Jeżeli energia elektronu znacznie przekracza energię jonizacji, to powstały jon cząsteczkowy otrzymuje nadmiar energii, która może wystarczyć do zerwania w nim wiązań. Jon cząsteczkowy rozpada się na cząstki o mniejszej masie (fragmenty). Taki proces nazywa się podział . W praktyce spektrometrii mas wykorzystuje się elektrony o energii 30÷100 eV, co zapewnia fragmentację jonu cząsteczkowego.
Jony cząsteczkowe Są to jony, których masy są równe masie zjonizowanej cząsteczki. Niestety nie ma bezpośrednich metod określania struktury jonów. Dlatego często stosuje się założenie o identyczności struktury jonu cząsteczkowego (M+) i cząsteczki obojętnej (M). Prawdopodobieństwo utworzenia jonu cząsteczkowego jest większe w przypadku prostych, małych cząsteczek. Wraz ze wzrostem liczby atomów w cząsteczce wzrasta prawdopodobieństwo fragmentacji jonu cząsteczkowego.
Istnieją dwa główne typy fragmentacji jonu cząsteczkowego - dysocjacja i rearanżacja.
Dysocjacja- rozpad jonu cząsteczkowego z zachowaniem sekwencji wiązań. W wyniku procesu powstaje kation i rodnik:
Dysocjacja węglowodorów prowadzi do fragmentów o nieparzystych stosunkach m/z.
przegrupowanie towarzyszy zmiana sekwencji wiązań, w wyniku której powstaje nowy kation rodnikowy o mniejszej masie i obojętnej stabilnej cząsteczce (H 2 O, CO, CO 2 itp.):
Przegrupowanie węglowodorów i związków zawierających tlen prowadzi do fragmentu o równomiernym stosunku m/z. Pomiar masy otrzymanych fragmentów i ich względnej ilości dostarcza cennych informacji na temat budowy związków organicznych.
Rozważmy urządzenie spektrometru masowego (ryc. 1). Spektrometr mas musi zawierać jednostki do realizacji następujących funkcji: 1) jonizacja próbki, 2) przyspieszenie jonów przez pole elektryczne, 3) rozkład jonów zgodnie ze stosunkiem m/z, 4) detekcja jonów za pomocą odpowiedniego sygnału elektrycznego .
Rys.1. Urządzenie do spektrometru mas
1 - źródło elektronów; 2 - komora jonizacyjna; 3 - płytki przyspieszające (potencjał ujemny); 4 - magnes; 5 - gniazdo;
6 - kolektor jonów (detektor jonów)
Aby uzyskać widmo masowe, do komory jonizacyjnej wprowadzane są w niewielkich ilościach opary substancji za pomocą specjalnego systemu zaciągania. (2) , gdzie utrzymywana jest głęboka próżnia (ciśnienie 10 -6 mm Hg). Cząsteczki substancji są bombardowane strumieniem elektronów emitowanym przez gorącą katodę (1). Powstałe jony są wypychane z komory jonizacyjnej przy niewielkiej różnicy potencjałów (3). Powstały przepływ jonów jest przyspieszany, skupiany przez silne pole elektryczne i wchodzi w pole magnetyczne. (4).
W wyniku bombardowania cząsteczek materii przez elektrony powstają cząstki o ładunku dodatnim lub ujemnym, a także cząstki obojętne. Gdy strumień cząstek przechodzi przez pole magnetyczne, cząstki obojętne nie zmieniają kierunku, natomiast cząstki dodatnie i ujemne są odchylane w różnych kierunkach. Odchylenie jonów jest proporcjonalne do ich ładunku i odwrotnie proporcjonalne do ich masy.
Każdy pojedynczy jon, charakteryzujący się określoną wartością m/z, porusza się po własnej trajektorii dla danej siły pola magnetycznego. Interwał skanowania masy można zmienić poprzez zmianę natężenia pola magnetycznego lub potencjału pola elektrycznego.
W konwencjonalnej spektrometrii mas zwykle rejestruje się tylko cząstki, które mają ładunek dodatni, ponieważ. gdy cząsteczki są bombardowane elektronami, zazwyczaj jest więcej jonów naładowanych dodatnio niż ujemnie. Jeśli konieczne jest badanie jonów naładowanych ujemnie, należy zmienić znak potencjału przyspieszenia (płytki przyspieszenia).
Jeżeli na wyjściu jonów z pola magnetycznego zainstalowane jest urządzenie rejestrujące, to cząstki różniące się wartością m/z będą dawać oddzielne sygnały. Intensywność sygnału będzie proporcjonalna do liczby cząstek o danej wartości m/z. Natężenie sygnałów określa się jako ich wysokość wyrażoną w mm. Wysokość piku o maksymalnej intensywności przyjmuje się jako 100% (pik podstawowy), intensywność pozostałych pików jest obliczana ponownie proporcjonalnie i wyrażana w procentach.
Wraz ze wzrostem stosunku m/z maleje różnica odchylenia przez pole magnetyczne cząstek różniących się o jedną jednostkę masy atomowej. W związku z tym ważną cechą spektrometrów mas jest ich rozdzielczość (R) , która określa maksymalną masę jonów różniących się o jedną jednostkę masy atomowej (dla której przyrząd oddziela piki o co najmniej 90%):
gdzie M jest maksymalną masą, dla której nakładanie się pików jest mniejsze niż 10%; ΔM to jedna jednostka masy atomowej.
Standardowe urządzenia mają R ≈ 5000/1, a dla urządzeń z podwójnym skupieniem strumienia jonów R 10000/1 i więcej. Takie urządzenia są w stanie uchwycić różnicę w masie cząsteczkowej jonów do 0,0001. Spektrometr mas z podwójnym ogniskowaniem może z łatwością oddzielić piki jonów o tych samych nominalnych masach cząsteczkowych, ale o różnym składzie pierwiastkowym. Na przykład może rozróżnić N2 (28.0061), CO (27.9949) i C2H4 (28.0313).
Ustalenie wzoru empirycznego na podstawie danych z widma mas nie jest łatwym zadaniem, ale można je rozwiązać za pomocą odpowiedniego algorytmu. Aby uzyskać widmo masowe, wymagana jest znikoma ilość substancji - około 1 μg.
2. Jonizacja chemiczna (CI).
W tej metodzie próbkę rozcieńcza się dużym nadmiarem „gazu odczynnikowego” przed napromieniowaniem wiązką elektronów. Prawdopodobieństwo zderzeń pierwotnych jonizacji między elektronami a cząsteczkami próbki jest wtedy tak małe, że jony pierwotne powstają prawie wyłącznie z cząsteczek reagentów. Jako reagenty zwykle stosuje się gazy o niskiej masie cząsteczkowej, takie jak CH4, ISO-C4H10, NH3 i gazy obojętne (Ar, He). Jony wtórne powstają w wyniku przeniesienia atomu wodoru lub elektronu.
Jeżeli gazem reakcyjnym jest metan, to reakcje przebiegają w następującej kolejności:
CH 4 + ē → CH 4 + + 2ē
CH 4 + + ē → CH 3 + + H + + 2ē
CH 4 + + CO 4 → CO 5 + +CH3
CH3 + + CH4 → C2H5 + +H2
R-CH3 + CH5 + → R-CH 4 + +CH4
gdzie R-CH 3 jest cząsteczką substancji badanej.
Badania wykazały, że cząsteczki CH 5 + i C2H5 + razem stanowią około 90% jonów obecnych w tym układzie. Widma masowe uzyskane po jonizacji chemicznej są znacznie prostsze, zawierają mniej pików i dlatego często są łatwiejsze do interpretacji.
Elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR) to zjawisko rezonansowej absorpcji promieniowania elektromagnetycznego przez substancję paramagnetyczną umieszczoną w stałym polu magnetycznym. Jest to spowodowane przejściami kwantowymi pomiędzy podpoziomami magnetycznymi atomów paramagnetycznych i jonów (efekt Zeemana). Widma EPR obserwowane są głównie w zakresie częstotliwości mikrofalowych.
Metoda elektronowego rezonansu paramagnetycznego umożliwia ocenę efektów pojawiających się w widmach EPR pod wpływem obecności lokalnych pól magnetycznych. Z kolei lokalne pola magnetyczne odzwierciedlają wzór oddziaływań magnetycznych w badanym układzie. Tym samym metoda spektroskopii EPR umożliwia badanie zarówno struktury cząstek paramagnetycznych, jak i oddziaływania cząstek paramagnetycznych z otoczeniem.
Spektrometr EPR przeznaczony jest do rejestracji widm i pomiaru parametrów widm próbek substancji paramagnetycznych w fazie ciekłej, stałej lub proszkowej. Znajduje zastosowanie przy wdrażaniu istniejących i opracowywaniu nowych metod badania substancji metodą EPR w różnych dziedzinach nauki, techniki i opieki zdrowotnej: na przykład do badania właściwości funkcjonalnych płynów biologicznych z widm wprowadzonych do nich sond spinowych w medycynie; wykrywanie rodników i określanie ich stężenia; w badaniu ruchliwości wewnątrzcząsteczkowej w materiałach; w rolnictwie; w geologii.
Podstawowym urządzeniem analizatora jest zespół spektrometryczny - spektrometr elektronowego rezonansu paramagnetycznego (spektrometr EPR).
Analizator zapewnia możliwość badania próbek:
- z regulatorami temperatury - układy kontroli temperatury próbek (w tym w zakresie temperatur od -188 do +50 ºC oraz przy temperaturze ciekłego azotu);
- w kuwetach, ampułkach, kapilarach i probówkach z wykorzystaniem systemów automatycznej zmiany próbek i dozowania.
Cechy działania spektrometru EPR
Próbka paramagnetyczna w specjalnej celi (ampułce lub kapilarze) umieszczana jest wewnątrz działającego rezonatora umieszczonego pomiędzy biegunami elektromagnesu spektrometru. Do rezonatora wchodzi elektromagnetyczne promieniowanie mikrofalowe o stałej częstotliwości. Stan rezonansu uzyskuje się poprzez liniową zmianę natężenia pola magnetycznego. Aby zwiększyć czułość i rozdzielczość analizatora, stosuje się modulację pola magnetycznego o wysokiej częstotliwości.
Gdy indukcja pola magnetycznego osiąga wartość charakterystyczną dla danej próbki, następuje rezonansowa absorpcja energii tych oscylacji. Przetworzone promieniowanie trafia następnie do detektora. Po wykryciu sygnał jest przetwarzany i podawany do urządzenia rejestrującego. Modulacja wysokoczęstotliwościowa i detekcja fazoczuła przekształca sygnał EPR w pierwszą pochodną krzywej absorpcji, w której następuje rejestracja widm elektronowego rezonansu paramagnetycznego. W tych warunkach rejestrowana jest również zintegrowana linia absorpcyjna EPR. Przykład zarejestrowanego widma absorpcji rezonansowej pokazano na poniższym rysunku.
