Aplikácia metódy elektrónovej paramagnetickej rezonancie pri štúdiu olejov a rozptýlených organických látok. Elektronická paramagnetická rezonancia. metóda EPR. Aplikácie Elektronická rezonancia
EPR
Princíp metódy EPR
História objavu metódy EPR
metóda EPR je hlavnou metódou na štúdium paramagnetických častíc prítomných v biologických systémoch. Paramagnetické častice veľkého biologického významu zahŕňajú dva hlavné typy zlúčenín - to súvoľné radikály A kovy s premenlivou valenciou (ako napr Fe, Cu, Co, Ni, Mn) alebo ich komplexy. Okrem stavov voľných radikálov sa metóda EPR používa na štúdium tripletových stavov, ktoré vznikajú v priebehu fotobiologických procesov.
Metóda elektrónovej paramagnetickej rezonancie bola objavená pomerne nedávno – v r 1944 . na Kazanskej univerzite od Jevgenija Konstantinoviča ZAVOYSKÉHO pri štúdiu absorpcie elektromagnetickej energie paramagnetickými soľami kovov. Všimol si, že monokryštál CuCl2, umiestnený v konštantnom magnetickom poli 40 Gauss (4 mT) začne absorbovať mikrovlnné žiarenie s frekvenciou asi 133 MHz.
Priekopníkmi využitia EPR v biologickom výskume v ZSSR boli L.A. Blumenfeld a A.E. Kalmanson, ktorý v roku 1958 publikoval v časopise Biophysics článok o štúdiu voľných radikálov produkovaných pôsobením ionizujúceho žiarenia na proteíny.
Mechanické a magnetické momenty elektrónu
Orbitálny a spinový pohyb elektrónov je základom ich orbitálnych a spinových mechanických momentov. Orbitálny moment hybnosti elektrónu R pozdĺž obežnej dráhy s polomerom R rovná sa:
Kde ja je prúd v obvode a S - oblasť obrysu (v tomto prípade sa kruhová dráha rovná pR2 ). Nahradením výrazu pre oblasť vo vzorci (2) a berúc do úvahy, že:
Porovnaním výrazov pre mechanické a magnetické momenty elektrónu (1) a (4) môžeme napísať, že:
Kde n - orbitálne kvantové číslo, ktoré nadobúda hodnoty 0, 1, 2 a m V tomto prípade, berúc do úvahy (6), výraz pre magnetický orbitálny moment bude vyzerať takto:
Spinový magnetický moment elektrónu je spojený so spinovým pohybom elektrónu, ktorý možno znázorniť ako pohyb okolo vlastnej osi. Mechanický spinový moment elektrónu sa rovná:
|
|
Kde S - spinové kvantové číslo rovné 1/2 .
Magnetické a mechanické spinové momenty sú spojené vzťahom:
|
| (10) |
Kde PANI
- magnetické kvantové číslo, rovné +1/2
. Pomer magnetického momentu k mechanickému momentu sa nazýva gyromagnetický pomer ( g
). Je možné vidieť, že pre orbitálny pohyb: 
a na zatočenie: 
Pre gyromagnetický pomer elektrónov s rôznymi príspevkami orbitálneho a spinového pohybu sa zavádza koeficient úmernosti g
, a to tak, že:
|
| (11) |
Tento faktor proporcionality sa nazýva g - faktor. g =1, at S =0, t.j. keď nedochádza k rotačnému pohybu elektrónu a existuje iba orbitálny pohyb, a g = 2, ak neexistuje žiadny orbitálny pohyb a existuje iba rotačný pohyb (napríklad pre voľný elektrón).
Magnetický moment elektrónu sa vo všeobecnosti skladá zspin a orbitalmagnetické momenty. Vo väčšine prípadov je však orbitálny magnetický moment nulový. Preto pri diskusii o princípe metódy ýïr ibaspinový magnetický moment.
Zeemanov efekt
Energiu interakcie magnetického momentu elektrónu s magnetickým poľom vyjadruje rovnica:
| (12) |
Kde m H - sila magnetického poľa, cos( mH ) je kosínus uhla medzi m A H .
Zeemanov efekt (obr. 1) ( ES =+1/2 A ES =-1/2 )
Z rovnice (11) vyplýva, že:
V tomto prípade bude rozdiel v energii medzi týmito dvoma úrovňami:
|
| (15) |
Rovnica (14) popisuje Zeemanov efekt, ktorý možno vyjadriť nasledujúcimi slovami:energetické hladiny elektrónov umiestnených v magnetickom poli sa v tomto poli rozdeľujú v závislosti od veľkosti spinového magnetického momentu a intenzity magnetického poľa.
Základná rezonančná rovnica
Počet elektrónov s konkrétnou energiou sa určí v súlade s Boltzmannovým rozdelením, a to:
Ak sa teraz elektromagnetická energia aplikuje na systém elektrónov v magnetickom poli, potom pri určitých hodnotách energie dopadajúceho kvanta dôjde k prechodom elektrónov medzi úrovňami. Nevyhnutnou podmienkou prechodov je rovnosť energie dopadajúceho kvanta ( hn ) energetický rozdiel medzi hladinami elektrónov s rôznymi spinmi ( gbH ).
|
| (17) |
Rovnica (17) vyjadruje hlavnú podmienku absorpcie energie elektrónmi. Pod vplyvom žiarenia budú elektróny, ktoré sú na vyššej energetickej hladine, emitovať energiu a vrátia sa na nižšiu hladinu, tento jav sa nazývaindukovaná emisia.
Elektróny na nižšej úrovni absorbujú energiu a presunú sa na vyššiu energetickú hladinu, tento jav sa nazývarezonančná absorpcia. Keďže pravdepodobnosti jednotlivých prechodov medzi energetickými hladinami sú rovnaké a celková pravdepodobnosť prechodu je úmerná počtu elektrónov v danej energetickej hladine, potomabsorpcia energie prevládne nad jej emisiou . Je to spôsobené tým, že ako vyplýva z rovnice (16), populácia nižšej úrovne je vyššia ako populácia hornej energetickej úrovne.
Na tomto mieste si treba všimnúť špeciálne postavenie voľných radikálov, t.j. molekuly s nepárovými elektrónmi vo vonkajšom elektrónovom orbitáli v rozložení elektrónov na energetických hladinách. Ak má orbitál pár elektrónov, potom prirodzene, populácia energetických hladín bude rovnaká a množstvo energie absorbovanej elektrónmi sa bude rovnať množstvu emitovanej energie.
Absorpcia energie látkou umiestnenou v magnetickom poli bude badateľná iba vtedy, ak je na obežnej dráhe iba jeden elektrón, potom bude možné hovoriť oBoltzmannovo rozdelenieelektróny medzi energetickými hladinami.
Charakteristika EPR spektier
Amplitúda signálu
Na stanovenie koncentrácie sa merajú plochy pod absorpčnou krivkou pre štandard so známou koncentráciou paramagnetických centier v meranej vzorke a neznámou koncentráciou; sa zistí z pomeru za predpokladu, že obe vzorky majú rovnaký tvar a objem:
|
| (18) |
Kde C rev. A C toto. - koncentrácie meraná vzorka a štandard, resp S rev. A S toto. - oblasť pod absorpčnými čiarami meraného signálu a štandardu.
Na určenie oblasti pod absorpčnou čiarou neznámeho signálu môžete použiť metódu numerickej integrácie:
Kde f(H) - prvá deriváciaabsorpčné čiary (EPR spektrum), F(H) - funkciu absorpčné línie a H - napätie magnetické pole.
Kde f"(H) je prvým derivátom absorpčnej línie, príp EPR spektrum . Vzhľadom na to je ľahké prejsť od integrálu k interkálnemu súčtu H=n*DH , dostaneme:
|
| (21) |
Kde D.H. je krokom zmeny magnetického poľa a n i - číslo kroku.
Plocha pod absorpčnou krivkou sa teda bude rovnať súčinu druhej mocniny kroku magnetického poľa a súčtu súčinov amplitúdy EPR spektra a čísla kroku. Z výrazu (21) je ľahké vidieť, že pre veľké n (t.j. ďaleko od stredu signálu) môže byť príspevok vzdialených častí spektra dosť veľký aj pri malých hodnotách amplitúdy signálu.
Tvar čiary
Hoci podľa základnej rezonančnej rovnice k absorpcii dochádza až vtedy, keď sa energia dopadajúceho kvanta rovná energetickému rozdielu medzi hladinami nepárových elektrónov, EPR spektrum nie je čiara, ale nepretržitý v niektorom okolí rezonančného bodu. Zavolá sa funkcia popisujúca signál EPRfunkcia tvaru čiary . V zriedených roztokoch, keď je možné zanedbať interakciu medzi paramagnetickými časticami, je absorpčná krivka opísaná Lorentzovou funkciou:
Gaussova funkcia je obálka EPR spektrum, ak existuje interakcia medzi paramagnetickými časticami. Pri určovaní plochy pod absorpčnou krivkou je obzvlášť dôležité zvážiť tvar čiary. Ako je zrejmé zo vzorcov (22) a (23), Lorentzova funkcia má pomalší pokles a teda aj širšie krídla, čo môže spôsobiť značnú chybu pri integrácii spektra.
Šírka čiary
Šírka spektra EPR závisí od interakcie magnetického momentu elektrónu s magnetickými momentmi okolitých jadier(mriežka) a elektróny.
Pozrime sa podrobnejšie na mechanizmus absorpcie energie nespárovanými elektrónmi. Ak v nízkoenergetickom stave existuje N 1 elektróny a vysokoenergetické N 2 a N ešte 1 N 2, potom, keď sa na vzorku aplikuje elektromagnetická energia, rozdiel v populáciách hladín sa bude znižovať, až kým nebude rovný nule.
Je to preto, že pravdepodobnosti jediného prechodu pôsobením žiarenia z nízkoenergetického stavu do vysokoenergetického stavu a naopak ( W 12 a W 21) sú si navzájom rovné a populácia nižšej úrovne je vyššia. Predstavme si premennú n =N 1 -N 2. Potom možno zapísať zmenu rozdielu v populáciách úrovní v priebehu času:
A 
; kde
| (24) |
V experimente však nie je pozorovaná žiadna zmena rozdielu v úrovni populácie v dôsledku skutočnosti, že existujú relaxačné procesy, ktoré udržiavajú tento rozdiel konštantný. Relaxačný mechanizmus spočíva v prenose kvanta elektromagnetickej energie do mriežky alebo okolitých elektrónov a návrate elektrónu na nízkoenergetickú úroveň.
Ak označíme pravdepodobnosti prechodov indukovaných mriežkou ako P 12 a P 21 a P o 12 menej P 21, potom zmena v rozdiele medzi populáciou bude:
V stacionárnom stave, keď je zmena populačného rozdielu nulová, počiatočný rozdiel v populáciách na úrovni ( n 0) zostáva konštantná a rovná sa:
Alebo vymeniť P 12 +P 21 na 1/T 1, dostaneme
|
| (29) |
Hodnota T 1 volalaspin-mriežkový relaxačný časa charakterizuje priemernú životnosť spinového stavu. Výsledkom je, že zmena populačného rozdielu medzi úrovňami systému nepárových elektrónov, ktorý je pod vplyvom elektromagnetického žiarenia a interaguje s mriežkou, bude určená rovnicou:
A pri 2WT 1 oveľa menej 1 , n = n 0 , t.j. pri relatívne nízkych mocnostiach, úrovňový populačný rozdiel prakticky zostáva konštantný . Z Heisenbergovho vzťahu neurčitosti vyplýva, že:
|
| (32) |
Ak to prijmeme Dt rovná sa T 1, a DE zodpovedá gbDH , potom možno rovnicu (32) prepísať ako:
|
| (33) |
Tie. neistota šírky čiary je nepriamo úmerná relaxačnému času spinovej mriežky.
Okrem interakcie magnetického momentu nepárového elektrónu s mriežkou je možná aj jeho interakcia s magnetickými momentmi iných elektrónov. Táto interakcia vedie k skráteniu relaxačného času a tým k rozšíreniu línie v EPR spektre. V tomto prípade sa zavádza koncept spin-spin relaxačného času ( T 2). Pozorovaný relaxačný čas sa považuje za súčet relaxačných časov spin-mriežky a spin-spin.
Pre voľné radikály v roztokoch T 1 oveľa menej T 2, takže šírka čiary bude určená T 2. Medzi mechanizmami rozširovania línie treba spomenúť nasledovné:interakcia dipól-dipól; anizotropia g-faktora; dynamické rozšírenie línie a výmena spinov .
Dipól-dipólová interakcia je založená na interakcii magnetického momentu nepárového elektrónu s lokálnym magnetickým poľom vytvoreným susednými elektrónmi a jadrami. Sila magnetického poľa v ktoromkoľvek bode závisí od vzdialenosti k tomuto bodu a vzájomnej orientácie magnetických momentov nepárového elektrónu a iného interagujúceho elektrónu alebo jadra. Zmena energie nepárového elektrónu bude určená:
| (34) |
Kde m je magnetický moment elektrónu, R - vzdialenosť od zdroja miestneho magnetického poľa, q je uhol medzi interagujúcimi magnetickými momentmi.
Príspevok anizotropie g Faktor rozšírenia EPR línie je spôsobený tým, že orbitálny pohyb elektrónu vytvára striedavé magnetické pole, s ktorým interaguje spinový magnetický moment. Táto interakcia vedie k odchýlke g - faktor hodnoty 2,0023 zodpovedajúcevoľný elektrón.
Pre kryštalické vzorky hodnoty g -faktor zodpovedajúci orientácii kryštálu denot g xx, g yy a g zz resp. Keď sa molekuly rýchlo pohybujú, napríklad v roztokoch, anizotropia g -faktor možno spriemerovať.
Rozšírenie EPR signálu môže byť spôsobené vzájomnou transformáciou dvoch foriem radikálu. Ak má teda každá z foriem radikálu svoje vlastné spektrum EPR, potom zvýšenie miery vzájomnej transformácie týchto foriem do seba povedie k rozšíreniu línie, pretože v tomto prípade sa životnosť radikálu v každom stave znižuje. Táto zmena šírky signálu sa nazývadynamické rozšírenie signálu. Výmena rotácie je ďalším spôsobom rozšírenia signálu EPR. Mechanizmus rozšírenia signálu pri spinovej výmene spočíva v zmene smeru spinového magnetického momentu elektrónu na opačný pri jeho zrážke s iným nepárovým elektrónom alebo iným paramagnetom.
Pretože takáto kolízia znižuje životnosť elektrónu v danom stave, EPR signál sa rozširuje. Najčastejším prípadom rozšírenia EPR línie mechanizmom výmeny spinov je rozšírenie signálu v prítomnosti kyslíka alebo paramagnetických kovových iónov.
Hyperjemná štruktúra
Rozdelenie čiary EPR na niekoľko je založené na fenoméne hyperjemnej interakcie, t.j. interakcie magnetických momentov nepárových elektrónov ( M S) s magnetickými momentmi jadier ( M N).
|
| Pretože v prítomnosti magnetického momentu jadra sa celkový magnetický moment rovná M S+ M N, kde M S je magnetický moment elektrónu a M N je magnetický moment jadra, potom celkové magnetické pole H sumy. = H 0 ± H lok. , Kde H lok. - lokálne magnetické pole vytvorené magnetickým momentom jadra. |
Dôležitou črtou hyperjemnej interakcie sú pravidlá výberu pre prechody medzi úrovňami. Povolené prechody sú prechody, pri ktorých sa mení spinový magnetický moment nespárovaného elektrónu ( DM S) rovná sa 1 a spinový magnetický moment jadra ( DM N) sa rovná 0 .
V príklade, ktorý sme uvažovali, bol spin jadra interagujúceho s nespárovaným elektrónom polovičný a rovnal sa ± 1/2, čo nám nakoniec poskytlo rozdelenie na dve línie. Toto točenie je typické pre protóny . V jadrách atómov dusíka ( N 14) rotácia celého čísla. Môže nadobudnúť hodnoty ±1 A 0 . V tomto prípade, keď nepárový elektrón interaguje s jadrom atómu dusíka, bude pozorované rozdelenie na tri identické čiary zodpovedajúce hodnote spinu. +1 , -1 A 0 . Vo všeobecnom prípade je počet čiar v spektre EPR rovný 2 mil N+ 1 .
Prirodzene, počet nepárových elektrónov a teda plocha pod krivkou absorpcie EPR nezávisia od veľkosti jadrového spinu a sú konštantnými hodnotami. Preto pri rozdelení jedného signálu EPR na dva alebo tri bude intenzita každej zložky in 2 alebo 3 krát nižšia.
Veľmi podobný obraz vzniká, ak nespárovaný elektrón interaguje nie s jedným, ale s niekoľkými ekvivalentnými (s rovnakou hyperjemnou interakčnou konštantou) jadrami, ktoré majú magnetický moment iný ako nula, napríklad dva protóny. V tomto prípade vznikajú tri stavy zodpovedajúce orientácii protónových spinov:
1. obaja na ihrisku,
2. obaja proti poli
3. jeden na ihrisku a jeden proti ihrisku.
Možnosť 3 je dvakrát pravdepodobnejšie ako 1 alebo 2 , pretože možno vykonať dvoma spôsobmi. V dôsledku takéhoto rozloženia nepárových elektrónov sa jedna čiara rozdelí na tri čiary s pomerom intenzity 1:2:1 . Vo všeobecnosti pre n ekvivalentné jadrá so spin M N počet riadkov je 2 nM N+ 1 .
Rádiový spektrometer EPR
Zariadenie rádiového spektrometra EPR v mnohom pripomína zariadenie spektrofotometra na meranie optickej absorpcie vo viditeľnej a ultrafialovej časti spektra.
Zdrojom žiarenia v rádiovom spektrometri je klystron, čo je rádiová lampa, ktorá vydáva monochromatické žiarenie v rozsahu centimetrových vĺn. Apertúra spektrofotometra v rádiospektrometri zodpovedá atenuátoru, ktorý umožňuje dávkovať výkon dopadajúci na vzorku. Kyveta so vzorkou v rádiovom spektrometri je umiestnená v špeciálnej jednotke nazývanej rezonátor. Rezonátor je rovnobežnosten s valcovou alebo pravouhlou dutinou, v ktorej je umiestnená absorbujúca vzorka. Rozmery rezonátora sú také, aby sa v ňom vytvorila stojatá vlna. Chýbajúcim prvkom v optickom spektrometri je elektromagnet, ktorý vytvára konštantné magnetické pole potrebné na rozdelenie energetických hladín elektrónov.
Žiarenie, ktoré prešlo meranou vzorkou, v rádiovom spektrometri a v spektrofotometri, dopadá na detektor, následne sa signál detektora zosilní a zaznamená na záznamník alebo počítač. Je potrebné poznamenať ešte jeden rozdiel rádiospektrometra. Spočíva v tom, že žiarenie rádiového dosahu sa prenáša zo zdroja do vzorky a následne do detektora pomocou špeciálnych pravouhlých trubíc nazývaných vlnovody. Rozmery prierezu vlnovodov sú určené vlnovou dĺžkou prenášaného žiarenia. Táto vlastnosť prenosu rádiovej emisie cez vlnovody určuje skutočnosť, že na záznam EPR spektra v rádiovom spektrometri sa používa konštantná frekvencia žiarenia a rezonančný stav sa dosahuje zmenou veľkosti magnetického poľa.
Ďalšou dôležitou vlastnosťou rádiového spektrometra je zosilnenie signálu pomocou jeho modulácie vysokofrekvenčným striedavým poľom. V dôsledku modulácie signálu sa diferencuje a absorpčná čiara sa premieňa na svoju prvú deriváciu, ktorou je signál EPR.
EPR signály pozorované v biologických systémoch
Využitie metódy EPR v biologickom výskume je spojené so štúdiom dvoch hlavných typov paramagnetických centier – voľných radikálov a kovových iónov premenlivej valencie. Štúdium voľných radikálov v biologických systémoch je spojené s ťažkosťami, ktoré spočívajú v nízkej koncentrácii voľných radikálov vznikajúcich počas životnej aktivity buniek. Koncentrácia radikálov v normálne metabolizujúcich bunkách je podľa rôznych zdrojov približne 10 -8 - 10 -10 mil , pričom moderné rádiospektrometre umožňujú merať koncentrácie radikálov 10 -6 - 10 -7 mil.
Koncentráciu voľných radikálov môžete zvýšiť spomalením ich smrti a zvýšením rýchlosti ich tvorby. Dá sa to dosiahnuť ožarovaním (UV alebo ionizujúcim žiarením) biologických predmetov pri nízkych teplotách.
Štúdium štruktúry radikálov viac či menej zložitých biologicky dôležitých molekúl bolo jednou z prvých oblastí aplikácie metódy EPR v biologickom výskume.
EPR spektrá cysteínu ožiareného UV žiarením
EPR spektrum pečene potkana
Ďalšou dôležitou oblasťou aplikácie metódy EPR v biologickom výskume bolo štúdium kovov s premenlivou mocnosťou a/alebo ich komplexov, ktoré existujú.in vivo.
Ak sa pozriete na spektrum EPR, napríklad pečene potkana, môžete vidieť signály cytochrómu R-450 majúce g - faktor 1,94 A 2,25 , methemoglobínový signál s g - faktor 4,3 a signál voľných radikálov patriacich k semichinónovým radikálom kyseliny askorbovej a flavínov s g - faktor 2,00 .
V dôsledku krátkych relaxačných časov je možné EPR signály metaloproteínov pozorovať len pri nízkych teplotách, ako je napríklad tekutý dusík.
Signály EPR niektorých radikálov však možno pozorovať aj pri teplote miestnosti. Tieto signály zahŕňajú EPR signály mnohých semichinónových alebo fenoxylových radikálov, ako je semichinónový radikál ubichinónu, fenoxy a semichinónový radikál a-tokoferolu (vitamín E), vitamín A D, a veľa ďalších.
ELEKTRONICKÁ PARAMAGNETICKÁ REZONANCIA (EPR)- rezonančná absorpcia elektromagnetických vĺn látkami obsahujúcimi paramagnetické častice. Metódy založené na EPR našli široké uplatnenie v laboratórnej praxi. S ich pomocou študujú kinetiku chemických a biochemických reakcií (pozri Kinetika biologických procesov, Chemická kinetika), úlohu voľných radikálov v životne dôležitých procesoch organizmu za normálnych a patologických stavov (pozri Voľné radikály), mechanizmy vzniku výskyt a tok fotobiologických procesov (pozri Fotobiológia) atď.
Fenomén EPR objavil sovietsky vedec B.K. Zavoisky v roku 1944. Elektrónová paramagnetická rezonancia je charakteristická len pre paramagnetické častice, to znamená častice schopné magnetizácie, keď na ne pôsobí magnetické pole) s nekompenzovaným elektronickým magnetickým momentom, ktorý je zase spôsobený vlastným mechanickým momentom elektrónu - spinom. Elektróny majú zvláštny druh vnútorného pohybu, ktorý možno prirovnať k rotácii vrcholu okolo jeho osi. Súvisiaci moment hybnosti sa nazýva spin. V dôsledku spinu má elektrón permanentný magnetický moment nasmerovaný proti spinu. Vo väčšine molekúl sú elektróny usporiadané v orbitáloch tak, že ich spiny smerujú opačne, magnetické momenty sú kompenzované a signál EPR z nich nie je možné pozorovať. Ak magnetické pole elektrónu nie je kompenzované spinom iného elektrónu (to znamená, že molekula obsahuje nepárové elektróny), potom sa zaznamená signál EPR. Častice s nepárovými elektrónmi sú voľné radikály, ióny mnohých kovov (železo, meď, mangán, kobalt, nikel atď.), množstvo voľných atómov (vodík, dusík, alkalické kovy atď.).
Pri absencii vonkajšieho magnetického poľa môže byť smer (orientácia) magnetického momentu elektrónu v priestore ľubovoľný; energia takéhoto elektrónu nezávisí od orientácie jeho magnetického momentu. V súlade so zákonmi kvantovej mechaniky vo vonkajšom magnetickom poli nemôže byť orientácia magnetického momentu elektrónu ľubovoľná - môže byť nasmerovaná buď v smere magnetického poľa, alebo naopak.
V súlade s orientáciou magnetického momentu elektrónu môže jeho energia v magnetickom poli nadobudnúť tiež iba dve hodnoty: minimálnu E1 - keď je magnetický moment orientovaný "pozdĺž poľa" a maximálnu E2 - keď je orientovaný "proti poľu" a rozdiel energií týchto stavov (delta E ) vypočítame podľa vzorca: ΔE = gβH, kde β je Bohrov magnetón (jednotka merania magnetického momentu elektrónu), H je sila magnetického poľa g je konštanta v závislosti od elektrónovej štruktúry paramagnetickej častice. Ak je systém nepárových elektrónov vo vonkajšom magnetickom poli ovplyvnený elektromagnetickým žiarením, ktorého kvantová energia sa rovná ΔE, potom vplyvom žiarenia začnú elektróny prechádzať zo stavu s nižšou energiou do stavu s vyššia energia, ktorá bude sprevádzaná absorpciou žiarenia látkou.
EPR sa označuje ako metódy rádiovej spektroskopie, pretože na pozorovanie elektrónovej paramagnetickej rezonancie sa používa žiarenie v oblasti rádiovej frekvencie elektromagnetických vĺn.
EPR sa zaznamenáva pomocou špeciálnych prístrojov - rádiových spektrometrov. Zahŕňajú: elektromagnet, zdroj rádiofrekvenčného žiarenia, vedenie prenosu žiarenia od zdroja k vzorke (vlnovod), rezonátor, v ktorom sa nachádza skúmaná vzorka, systémy na detekciu, zosilnenie a záznam signálu. Najbežnejšie rádiové spektrometre, ktoré využívajú elektromagnetické žiarenie s vlnovými dĺžkami 3,2 cm alebo 8 mm.
Registrácia signálu EPR sa vykonáva nasledovne. Intenzita magnetického poľa vytvoreného elektromagnetom sa v určitých medziach lineárne mení. Pri hodnotách napätia zodpovedajúcich stavu rezonancie vzorka absorbuje energiu elektromagnetického žiarenia. Absorpčná čiara (signál EPR) je závislosť výkonu žiarenia absorbovaného vzorkou od intenzity magnetického poľa. V existujúcich rádiových spektrometroch sa EPR signál zaznamenáva ako prvá derivácia absorpčnej čiary.
Na popis a analýzu EPR spektier sa používa množstvo parametrov charakterizujúcich intenzitu čiar, ich šírku, tvar a polohu v magnetickom poli. Intenzita čiar EPR, ak sú ostatné veci rovnaké, je úmerná koncentrácii paramagnetických častíc, čo umožňuje vykonať kvantitatívnu analýzu.
Pri zvažovaní javu EPR treba brať do úvahy, že magnetický moment nespárovaného elektrónu interaguje nielen s magnetickým poľom elektromagnetu, ale aj s magnetickými poľami vytvorenými prostredím elektrónu: iné nepárové elektróny, magnetické jadrá (viď. jadrová magnetická rezonancia). Interakcia nepárových elektrónov s jadrami často vedie k rozdeleniu spektra EPR na množstvo čiar. Analýza takýchto spektier umožňuje identifikovať povahu paramagnetických častíc a vyhodnotiť povahu a stupeň ich vzájomnej interakcie.
Účasť paramagnetických častíc na chemických reakciách, molekulárnom pohybe a iných kinetických efektoch tiež ovplyvňuje tvar EPR spektra. Preto sa EPR používa na detekciu, kvantifikáciu a identifikáciu paramagnetických častíc, štúdium kinetiky chemických a biochemických reakcií a molekulárnej dynamiky.
Vďaka svojej všestrannosti je EPR široko používaný v rôznych oblastiach vedy. Využitie EPR v biológii a medicíne je spôsobené prítomnosťou v bunkách, tkanivách a biol. kvapaliny rôznych paramagnetických centier v prírode. Pomocou EPR bola zistená prítomnosť voľných radikálov takmer vo všetkých živočíšnych a rastlinných tkanivách. Zdrojom voľných radikálov sú zlúčeniny ako flavíny, koenzým Q a ďalšie látky, ktoré pôsobia ako nosiče elektrónov pri reakciách energetického metabolizmu v rastlinných a živočíšnych bunkách; paramagnetické centrá nachádzajúce sa v izolovaných tkanivách patria najmä do elektrónových transportných reťazcov mitochondrií, mikrozómov, chloroplastov (pozri Dýchanie). Zistilo sa, že obsah voľných radikálov v tkanivách koreluje s ich metabolickou aktivitou. Početné práce ukazujú zmenu počtu voľných radikálov v rôznych patologických stavoch, napríklad počas onkogenézy (pozri), rozvoj radiačného poškodenia (pozri), toxikózy (pozri Intoxikácia), čo sa vysvetľuje porušením energetického metabolizmu v patológie (pozri Bioenergetika).
Pomocou EPR v tkanivách živočíchov a rastlín sa stanovujú paramagnetické ióny (železo, meď, mangán, kobalt atď.), ktoré sú súčasťou metaloproteínov podieľajúcich sa na reakciách prenosu elektrónov pozdĺž elektrónových transportných reťazcov a enzymatickej katalýze. ako v pigmentoch prenášajúcich kyslík (hemoglobín). Pomocou EPR je možné študovať redoxné premeny kovových iónov a povahu interakcie iónov s ich prostredím, čo umožňuje stanoviť jemnú štruktúru komplexov obsahujúcich kov.
Patologické zmeny v tkanivách vedú k zmenám EPR signálov metaloproteínov, čo je spojené s rozpadom komplexov paramagnetických kovov, zmenami prostredia paramagnetických iónov a prechodom iónov na iné komplexy. Štúdium povahy paramagnetických centier tkanív, najmä voľných radikálov, je však spojené s určitými ťažkosťami v dôsledku zložitosti dešifrovania EPR spektier.
Pomocou EPR bolo možné skúmať mechanizmy enzymatických reakcií (pozri Enzýmy). Predovšetkým je možné súčasne študovať kinetiku tvorby a spotreby voľných radikálov počas enzymatických reakcií a kinetiku redoxných premien kovov, ktoré sú súčasťou enzýmov, čo umožňuje stanoviť postupnosť štádií enzymatického procesu. reakciu.
Využitie EPR pri štúdiu radiačného poškodenia v biol. objektov umožňuje získať informácie o povahe radikálov vznikajúcich v biopolyméroch, o mechanizmoch a kinetike radikálových reakcií, ktoré vznikajú v ožiarených objektoch a vedú k biologickému účinku. Metódu EPR je možné použiť v havarijnej dozimetrii, napríklad pri náhodnom ožiarení ľudí na posúdenie expozičnej dávky, pričom sa na to používajú predmety z expozičnej zóny.
Dôležité miesto má EPR pri štúdiu fotobiologických procesov s voľnými radikálmi (pozri Molekula, Voľné radikály, Fotobiológia, Fotosenzibilizácia). EPR sa používa na podrobné štúdium tvorby voľných radikálov v proteínoch, nukleových kyselinách a ich zložkách pôsobením ultrafialového žiarenia a úlohy týchto radikálov pri fotodegradácii biopolymérov (pozri Svetlo). Použitie EPR poskytlo dôležité informácie o primárnych mechanizmoch fotosyntézy (pozri). Ukázalo sa, že primárnou reakciou fotosyntézy je prenos elektrónu z molekuly chlorofylu excitovaného svetlom a vznik katiónu chlorofylového radikálu. Bola tiež identifikovaná povaha molekúl, ktoré prijímajú elektrón darovaný excitovanou molekulou chlorofylu.
EPR sa používa aj na štúdium štruktúry biologicky dôležitých makromolekúl a biomembrán. Napríklad ióny železa, ktoré sú súčasťou hemu v proteínoch obsahujúcich hem, môžu byť v stave s vysokým spinom (elektróny na vonkajších dráhach nie sú spárované, celkový spin je maximálny) a s nízkym spinom (vonkajšie elektróny sú úplne alebo čiastočne spárované). , rotácia je minimálna). Štúdie znakov EPR signálov vysokospinových a nízkospinových stavov iónov železa v hemoglobíne a jeho derivátoch prispeli k pochopeniu priestorovej štruktúry molekuly hemoglobínu.
Významný pokrok v štúdiu štruktúry biomembrán a biopolymérov sa dosiahol po nástupe metód spinovej sondy a značenia (pozri Biologické membrány). Ako spinové značky a sondy sa používajú hlavne stabilné nitroxidové radikály (pozri Voľné radikály). Nitroxylový radikál môže byť kovalentne naviazaný na molekuly (spin label) alebo zadržaný v skúmanom systéme v dôsledku fyzikálnych interakcií (spin sonda). Podstata spočíva v tom, že tvar EPR spektra nitroxidových radikálov závisí od vlastností mikroprostredia: viskozity, povahy a pohybu molekúl, lokálnych magnetických polí atď. Indikátorom sú spinové značky kovalentne viazané na rôzne skupiny biopolymérov. stavu biopolymérnej štruktúry. Pomocou spinových značiek sa študuje priestorová štruktúra biopolymérov, štrukturálne zmeny proteínov pri denaturácii, tvorba komplexov enzým-substrát, antigén-protilátka atď.
Metóda spinových sond sa využíva na štúdium spôsobov balenia a pohyblivosti lipidov v biomembránach, lipid-proteínové interakcie, štrukturálne prechody v membránach spôsobené pôsobením rôznych látok a pod. Na základe štúdia spinových značiek a sond, metód na stanovenie liečiv v biol. tekutín, ako aj problematika riadenej prepravy drog a pod.
S pomocou EPR sa teda v norme a v prípade akejkoľvek patológie zobrazuje široká distribúcia elektronických procesov v tele. Vytvorenie teórie a zdokonalenie technológie metódy EPR tvorilo základ kvantovej elektroniky ako vedného odboru, viedlo k vytvoreniu molekulárnych generátorov a zosilňovačov rádiových vĺn (maserov) a svetla - laserov (pozri), ktoré sú široko používané v mnohých oblastiach národného hospodárstva.
Blumenfeld L. A., Voevodsky V. V. a Semenov A. G. Aplikácia elektrónovej paramagnetickej rezonancie v chémii, Novosibirsk, 1962, bibliografia; Wertz J. a Bolton J. Teória a praktické aplikácie metódy EPR, prekl. z angl. M., 1975, bibliogr.; Ingram D. Elektrónová paramagnetická rezonancia v biológii, trans. z angličtiny M., 1972; Kalmanson A. E. Aplikácia metódy elektrónovej paramagnetickej rezonancie v biochémii, v knihe: Usp. biol. chem., ed. B. N. Stepanenko, zväzok 5, s. 289, M., 1963; Metóda sondy Kuznetsov A. N. Spin. M., 1976; Lichtenštajnsko G. I. Metóda spinových značiek v molekulárnej biológii, M., 1974; The Spin Label Method, ed. L. Berliner, prekl. z angličtiny, M., 1979; Voľné radikály v biológii, ed. W. Pryor, prekl. z angličtiny, zväzok 1, s. 88, 178, M., 1979.
K. N. Timofejev.
EPR spektrá sa môžu použiť na určenie valencie paramagnetického iónu a symetrie jeho prostredia, čo v kombinácii s údajmi röntgenovej štruktúrnej analýzy umožňuje určiť polohu paramagnetického iónu v kryštálovej mriežke. Hodnota energetických hladín paramagnetického iónu umožňuje porovnať výsledky EPR s údajmi optických spektier a vypočítať magnetickú susceptibilitu paramagnetov.
Metóda EPR umožňuje určiť povahu a lokalizáciu mriežkových defektov, ako sú farebné centrá. V kovoch a polovodičoch je možný aj EPR spojený so zmenou orientácie spinov vodivých elektrónov. Metóda EPR je široko používaná v chémii a biológii, kde v priebehu chemických reakcií alebo pri pôsobení ionizujúceho žiarenia môžu vznikať molekuly s nenaplnenou chemickou väzbou, voľné radikály. Ich g-faktor je zvyčajne blízky , a šírke čiary EPR 
malý. Kvôli týmto vlastnostiam sa jeden z najstabilnejších voľných radikálov (), ktorý má g = 2,0036, používa ako štandard pri meraniach ESR. V biológii EPR sa študujú enzýmy a voľné radikály v biologických systémoch a organokovové zlúčeniny.
EPR v silných magnetických poliach
Prevažná väčšina experimentálnych štúdií paramagnetickej rezonancie bola vykonaná v magnetických poliach, ktorých intenzita je menšia ako 20 ke. Medzitým by použitie silnejších statických polí a striedavých polí vyšších frekvencií výrazne rozšírilo možnosti metódy EPR a zvýšilo informácie, ktoré poskytuje. V blízkej budúcnosti permanentné magnetické polia až 250 ke a impulzívne polia merané v desiatkach miliónov oerstedov. To znamená, že Zeemanove štiepenia v konštantných poliach dosiahnu približne 25 
a v pulzných poliach sú hodnoty o dva rády väčšie. Low pomocou spektrometra so supravodivým magnetom zmeral EPR v poliach H0
65
ke. Prochorov a jeho kolegovia pozorovali EPR signály na vlnovej dĺžke 
=1,21mm.
Silné magnetické polia by mali byť veľkým prínosom pre emisiu iónov vzácnych zemín v kryštáloch, ktorých intervaly medzi Starkovými podúrovňami sú rádovo 10-100 
. EPR efekt v bežných poliach často chýba, pretože pozemná úroveň Starka sa ukáže ako singlet, alebo preto, že prechody medzi Zeemanovými podúrovňami pozemného Kramersovho dubletu sú zakázané. Účinok v dôsledku prechodov medzi rôznymi Stark podúrovňami je vo všeobecnosti možný. Ďalej je kryštálové pole v kryštáloch vzácnych zemín charakterizované veľkým počtom parametrov, na určenie ktorých znalostí g- tenzor hlavného Kramersovho dubletu nestačí.
Silné magnetické polia možno využiť aj na štúdium iónov skupiny železa, najmä ako napr 
ktoré majú delenia rádu 10 
100
.
Pri aplikácii na páry spojené s výmenou to umožňujú silné magnetické polia pozorovaním efektu v dôsledku prechodov medzi úrovňami s rôznymi hodnotami výsledného točenia S páry so spektroskopickou presnosťou merajú parameter výmennej interakcie J.
Paramagnetická rezonancia v silných magnetických poliach bude mať množstvo funkcií. K efektom saturácie magnetizáciou dôjde pri relatívne vysokých teplotách. Pri nie veľmi nízkych teplotách bude polarizácia iónových magnetických momentov taká silná, že okrem vonkajšieho magnetického poľa bude potrebné vniesť do rezonančných podmienok aj vnútorné pole. Ukáže sa závislosť rezonančných podmienok od tvaru vzorky.
Metóda EPR získala veľký význam v chémii, fyzike, biológii a medicíne, pretože umožňuje určiť štruktúry a koncentrácie organických a anorganických voľných radikálov. Voľné radikály môžu vznikať chemicky, fotochemicky alebo vysokoenergetickým žiarením.
EPR spektrum je dané voľnými radikálmi, molekulami s nepárnym počtom elektrónov, tripletovými stavmi organických molekúl, paramagnetickými iónmi prechodných kovov a ich komplexmi.
Metóda EPR sa začala používať v biologickom výskume v 50. rokoch minulého storočia. Pre svoju pomerne vysokú citlivosť a možnosť určenia povahy paramagnetických častíc našla táto metóda široké uplatnenie pri štúdiu množstva biologických procesov.
Okrem signálov voľných radikálov sa v tkanivách pozoruje množstvo kovových signálov (Fe, Cu, Mn, Ni, Co). Tieto kovy sú súčasťou metaloproteínov, ktoré sa podieľajú na množstve enzymatických procesov. Proteíny obsahujúce železo (cytochrómy, ferredoxíny) sú súčasťou elektrónových transportných reťazcov v mitochondriách a chloroplastoch.
Metódou EPR sa študovalo množstvo enzymatických systémov a našli sa produkty voľných radikálov substrátov. V mnohých prípadoch sa ukázalo, že je možné pozorovať redoxné premeny kovových iónov obsiahnutých v aktívnom centre enzýmu.
EPR spektroskopia je široko používaná pri štúdiách fotosyntézy: študuje sa mechanizmus primárnych štádií separácie náboja v reakčných centrách a ďalší prenos elektrónu pozdĺž elektrónového transportného reťazca.
Okrem štúdia mechanizmov reakcií prebiehajúcich za účasti paramagnetických častíc je metóda EPR široko používaná aj na štúdium štrukturálnych a dynamických vlastností makromolekúl a biomembrán.
V poslednej dobe sa na štúdium biologických a polymérnych systémov často používajú metódy „paramagnetickej sondy“, „spin label“ a „spin traps“. Všetky sú založené na použití stabilných radikálov kyseliny dusičnej rôznych štruktúr, resp. na analýze zmien šírky čiary EPR spektier spôsobených rotačnou a translačnou difúziou týchto radikálov.
Hlavnou myšlienkou metódy spinovej značky a sondy je pripojiť voľný radikál k jednej alebo druhej funkčnej skupine proteínu a študovať charakteristiky jeho EPR signálov. Najvhodnejšie sú v tomto ohľade nitroxylové radikály obsahujúce voľnú radikálovú skupinu:
kde R1 a R2 sú rôzne chemické skupiny.
Metóda rotácie štítkov spočíva v tom, že stabilný radikál je pripojený k neparamagnetickej molekule kovalentnou alebo inou väzbou, takže voľná valencia nie je ovplyvnená. Charakter pohybu sa jasne prejavuje vo forme spektra a slúži ako dôležitý zdroj informácií o pôvodnej molekule.
Ak je molekula integrovaná do molekuly proteínu a je tam držaná elektrostatickými silami alebo hydrofóbnymi interakciami, potom sa takáto molekula nazýva otočná sonda. Metóda je založená na štúdiu rotačnej a translačnej mobility radikálu sondy vo vodnom alebo organickom médiu alebo v polymérnej matrici. Pohyblivosť radikálu závisí od mobility molekúl prostredia, preto je radikál akýmsi molekulárnym senzorom štrukturálnych a dynamických informácií o lokálnom prostredí.
Tvar EPR signálu produkovaného spinovou značkou alebo sondou závisí od mikroprostredia nitroxy radikálu a predovšetkým od rotačnej pohyblivosti skupiny, v ktorej je zahrnutý.
Hlavnou nevýhodou spinových značiek a sond je to, že hoci sú tieto molekuly malé, keď sú zahrnuté v lipidovej dvojvrstve, trochu menia jej vlastnosti.
V srdci metódy "točiace pasce" je reakcia neparamagnetickej molekuly (pasce) špeciálne zavedenej do skúmaného systému s krátkotrvajúcim radikálom, ktorej výsledkom je vznik stabilného radikálu. Kinetické správanie výsledného stabilného radikálu a jeho štruktúra poskytujú informácie o kinetike a mechanizme procesov v skúmanom systéme.
Predmetom výskumu v chémii pomocou EPR spektroskopie sú: 1) voľné radikály v medziproduktoch organických reakcií; 2) reakčná kinetika; 3) chémia povrchových javov; 4) zničenie v dôsledku ožiarenia; 5) polymerizácia v dôsledku voľných radikálov; 6) voľné radikály zmrazené pri nízkych teplotách; 7) kovy s premenlivou mocnosťou a ich komplexy.
Metóda EPR predstavuje cenný príspevok k štúdiu kinetiky a mechanizmov chemických reakcií. Po prvé, merania šírky čiary v EPR spektrách môžu byť použité na určenie rýchlostných konštánt procesov zahŕňajúcich paramagnetické častice, ktorých charakteristická životnosť leží v rozsahu 10 -5 -10 -10 s. Po druhé, metóda EPR umožňuje detekovať paramagnetické častice s vysokou citlivosťou za rôznych podmienok, čo poskytuje cenné informácie o reakčných mechanizmoch. Po tretie, EPR spektrometer môže byť použitý ako analytické zariadenie na detekciu koncentrácie reagujúcich paramagnetických molekúl v priebehu reakcií. Počet paramagnetických centier vo vzorke je úmerný ploche pod absorpčným spektrom.
Metóda EPR je široko používaná na štúdium rýchlych procesov spojených so zmenami v molekulárnej štruktúre radikálov. Tieto procesy zahŕňajú bránenú rotáciu a konformačné prechody.
Pre krátkotrvajúce radikály možno citlivosť metódy zvýšiť použitím prietokového systému alebo kontinuálneho ožarovania. EPR spektrá nestabilných radikálov možno získať ich fixáciou v sklách, matriciach zmrazených vzácnych plynov alebo kryštáloch.
Otázky na pohovor
1. Teoretické základy metódy.
2. Analytické parametre spektra EPR.
3. EPR spektrometre.
4. Aplikácia EPR.
Testovacie úlohy
1. Rezonančná podmienka v metóde EPR:
a) n = gHo (1-s) / 2p; b) 5 \u003d (AH / H0); c) hn \u003d gpH0; d) 5 = (Δν/ν 0)/(ΔН/N 0).
2. Čo sa deje v momente rezonancie pri metóde EPR:
a) absorbujú sa kvantá žiarenia, nedochádza k reorientácii spinu;
b) absorbujú sa kvantá žiarenia a preorientujú sa spiny, t.j. prechod z nižšieho energetického stavu do vyššieho a naopak. Počet prechodov zdola nahor je väčší ako počet prechodov zhora nadol.
c) absorbujú sa kvantá žiarenia a preorientujú sa spiny, t.j. prechod z nižšieho energetického stavu do vyššieho a naopak. Počet prechodov zhora nadol je väčší ako počet prechodov zdola nahor.
3. Parametre EPR spektier:
a) g-faktor, šírka absorpčného pásma, intenzita absorpčnej čiary;
b) celkový počet signálov, intenzita signálu, chemický posun, multiplicita signálu;
c) g-faktor, šírka absorpčného pásma, intenzita absorpčnej čiary, HFS EPR spektrá.
HMOTNOSŤ SPEKROMETRIA
Táto metóda sa zásadne líši od spektroskopických metód. Metódy hmotnostnej spektrometrie sú založené na ionizácii látky, separácii iónov, podľa pomeru ( m/z) a registráciu hmotnosti výsledných fragmentov.
Teoretické a experimentálne základy hmotnostnej spektrometrie položil D.D. Thomson, ktorý v roku 1912 prvýkrát vytvoril zariadenie na získanie hmotnostného spektra kladných iónov. Jeho zariadenie však malo nízke rozlíšenie. Jeho študent F. Aston v roku 1918 výrazne zvýšil rozlíšenie a po prvýkrát objavil na svojom zariadení izotopy prvkov. Takmer súčasne s F. Astonom v Chicagu skonštruoval A. Dempster prvý hmotnostný spektrometer, v ktorom priečne magnetické pole slúžilo ako analyzátor a iónové prúdy sa merali elektrickými metódami. Jeho schéma sa používa aj v moderných zariadeniach.
Ionizácia molekúl by sa mala uskutočňovať za podmienok, za ktorých by vytvorený ión, bez ohľadu na spôsob ionizácie, nepodliehal žiadnym kolíziám s inými molekulami alebo iónmi. To je potrebné na stanovenie vzťahu medzi vlastnosťami iónu a molekuly.
Ionizačné metódy
Ionizácia sa môže uskutočňovať rôznymi spôsobmi.
1. Metóda ionizácie nárazom elektrónov (EI).
Ide o najbežnejšiu metódu získavania iónov vďaka jednoduchosti a dostupnosti iónových zdrojov a ich vysokej účinnosti. Predpokladajme, že parami látky prechádza prúd elektrónov, ktorých energia sa môže postupne zvyšovať. Ak táto energia dosiahne určitú úroveň, potom keď sa elektrón zrazí s molekulou, elektrón z nej môže byť „vyrazený“ vytvorením molekulárneho iónu:
polyatomická molekula molekulový ión (radikálový katión)
Najnižšia energia bombardujúcich elektrónov, pri ktorej sa nazýva vznik iónu z danej molekuly ionizačná energia hmoty. Ionizačná energia je mierou sily, s ktorou molekula drží elektrón, ktorý je na ňu najmenej viazaný. Pre organické molekuly je ionizačná energia 9 ÷ 12 eV.
Ak energia elektrónu výrazne prevyšuje ionizačnú energiu, potom výsledný molekulárny ión dostane prebytočnú energiu, ktorá môže byť dostatočná na rozbitie väzieb v ňom. Molekulárny ión sa rozpadá na častice menšej hmotnosti (fragmenty). Takýto proces sa nazýva fragmentácia . V praxi hmotnostnej spektrometrie sa používajú elektróny s energiou 30÷100 eV, čo zabezpečuje fragmentáciu molekulového iónu.
Molekulárne ióny Sú to ióny, ktorých hmotnosti sa rovnajú hmotnosti ionizovanej molekuly. Bohužiaľ neexistujú žiadne priame metódy na určenie štruktúry iónov. Preto sa často používa predpoklad o identite štruktúry molekulového iónu (M +) a neutrálnej molekuly (M). Pravdepodobnosť vytvorenia molekulárneho iónu je väčšia pre jednoduché, malé molekuly. S nárastom počtu atómov v molekule sa zvyšuje pravdepodobnosť fragmentácie molekulárneho iónu.
Existujú dva hlavné typy fragmentácie molekulárneho iónu - disociácia a preskupenie.
Disociácia- rozpad molekulového iónu so zachovaním sledu väzieb. V dôsledku tohto procesu sa vytvorí katión a radikál:
Disociácia uhľovodíkov vedie k fragmentom s nepárnymi pomermi m/z.
preskupovanie sprevádzaná zmenou poradia väzieb, čo vedie k vytvoreniu nového radikálového katiónu s menšou hmotnosťou a neutrálnej stabilnej molekuly (H 2 O, CO, CO 2 atď.):
Preskupenie uhľovodíkov a zlúčenín obsahujúcich kyslík vedie k fragmentu s rovnomerným pomerom m/z. Meranie hmotnosti výsledných fragmentov a ich relatívneho množstva poskytuje cenné informácie o štruktúre organických zlúčenín.
Uvažujme zariadenie hmotnostného spektrometra (obr. 1). Hmotnostný spektrometer musí obsahovať jednotky na vykonávanie týchto funkcií: 1) ionizácia vzorky, 2) zrýchlenie iónov elektrickým poľom, 3) rozdelenie iónov podľa pomeru m/z, 4) detekcia iónov zodpovedajúcim elektrickým signálom. .
Obr.1. Zariadenie hmotnostného spektrometra
1 - zdroj elektrónov; 2 - ionizačná komora; 3 - urýchľovacie platne (negatívny potenciál); 4 - magnet; 5 - štrbina;
6 - iónový kolektor (iónový detektor)
Aby sa získalo hmotnostné spektrum, pary látok sa v malých množstvách zavádzajú do ionizačnej komory pomocou špeciálneho nafukovacieho systému. (2) , kde je udržiavané hlboké vákuum (tlak 10 -6 mm Hg). Molekuly látky sú bombardované prúdom elektrónov emitovaných horúcou katódou (1). Výsledné ióny sú vytlačené z ionizačnej komory malým rozdielom potenciálov (3). Výsledný tok iónov sa zrýchli, zaostrí silným elektrickým poľom a dostane sa do magnetického poľa. (4).
V dôsledku bombardovania molekúl hmoty elektrónmi vznikajú častice, ktoré majú kladný alebo záporný náboj, ako aj neutrálne častice. Keď prúd častíc prechádza magnetickým poľom, neutrálne častice nemenia smer, zatiaľ čo kladné a záporné častice sú vychyľované rôznymi smermi. Vychýlenie iónov je úmerné ich náboju a nepriamo úmerné ich hmotnosti.
Každý jednotlivý ión, charakterizovaný špecifickou hodnotou m/z, sa pohybuje po svojej vlastnej trajektórii pre danú intenzitu magnetického poľa. Interval snímania hmoty možno meniť zmenou intenzity magnetického poľa alebo potenciálu elektrického poľa.
V konvenčnej hmotnostnej spektrometrii je zvykom registrovať len častice, ktoré majú kladný náboj, pretože. keď sú molekuly bombardované elektrónmi, zvyčajne je viac kladne nabitých iónov ako záporne nabitých iónov. Ak je potrebné študovať negatívne nabité ióny, malo by sa zmeniť znamienko akceleračného potenciálu (urýchľovacie platne).
Ak je na výstupe iónov z magnetického poľa nainštalované záznamové zariadenie, častice líšiace sa hodnotami m/z vydajú samostatné signály. Intenzita signálu bude úmerná počtu častíc s danou hodnotou m/z. Intenzita signálov je definovaná ako ich výška vyjadrená v mm. Výška píku s maximálnou intenzitou sa berie ako 100 % (základný pík), intenzita zostávajúcich píkov sa proporcionálne prepočíta a vyjadrí v percentách.
So zvyšovaním pomeru m/z sa zmenšuje rozdiel vo výchylke magnetickým poľom častíc, ktoré sa líšia o jednu jednotku atómovej hmotnosti. V tomto ohľade je dôležitou charakteristikou hmotnostných spektrometrov ich rozlíšenie (R) , ktorý určuje maximálnu hmotnosť iónov, ktoré sa líšia o jednu jednotku atómovej hmotnosti (pri ktorých prístroj oddeľuje píky aspoň o 90 %):
kde M je maximálna hmotnosť, pri ktorej je prekrytie vrcholu menšie ako 10 %; ΔM je jedna atómová hmotnostná jednotka.
Štandardné zariadenia majú R ≈ 5000/1 a pre zariadenia s dvojitým zaostrovaním toku iónov R ≈ 10000/1 a ešte viac. Takéto zariadenia sú schopné zachytiť rozdiel v molekulovej hmotnosti iónov až do 0,0001. Hmotnostný spektrometer s dvojitou fokusáciou môže ľahko oddeliť píky iónov s rovnakými nominálnymi molekulovými hmotnosťami, ale odlišným elementárnym zložením. Napríklad môže rozlišovať medzi N2 (28,0061), CO (27,9949) a C2H4 (28,0313).
Vytvorenie empirického vzorca z údajov o hmotnostnom spektre nie je jednoduchá úloha, ale dá sa vyriešiť pomocou vhodného algoritmu. Na získanie hmotnostného spektra je potrebné zanedbateľné množstvo látky - asi 1 μg.
2. Chemická ionizácia (CI).
Pri tejto metóde sa vzorka pred ožiarením elektrónovým lúčom zriedi veľkým prebytkom "reagenčného plynu". Pravdepodobnosť primárnych ionizačných zrážok medzi elektrónmi a molekulami vzorky je potom taká malá, že primárne ióny sa tvoria takmer výlučne z molekúl reaktantov. Ako reaktanty sa zvyčajne používajú plyny s nízkou molekulovou hmotnosťou, ako je CH4, ISO-C4H10, NH3 a inertné plyny (Ar, He). Sekundárne ióny vznikajú v dôsledku prenosu atómu vodíka alebo elektrónu.
Ak je reaktantom metán, reakcie prebiehajú v nasledujúcom poradí:
CH 4 + ē → CH 4 + + 2 ē
CH 4 + + ē → CH 3 + + H + + 2 ē
CH 4 + + CH4 → CH5 + +CH3
CH 3 + + CH4 -> C2H5 + +H2
R-CH3 + CH5 + → R-CH 4 + +CH4
kde R-CH3 je molekula testovanej látky.
Štúdie ukázali, že častice CH 5 + a C2H5 + spolu tvoria asi 90 % iónov prítomných v tomto systéme. Hmotnostné spektrá získané po chemickej ionizácii sú oveľa jednoduchšie, obsahujú menej píkov, a preto sa často ľahšie interpretujú.
Elektrónová paramagnetická rezonancia (EPR) je jav rezonančnej absorpcie elektromagnetického žiarenia paramagnetickou látkou umiestnenou v konštantnom magnetickom poli. Spôsobujú ho kvantové prechody medzi magnetickými podúrovňami paramagnetických atómov a iónov (Zeemanov efekt). EPR spektrá sú pozorované hlavne v mikrovlnnom frekvenčnom rozsahu.
Metóda elektrónovej paramagnetickej rezonancie umožňuje vyhodnotiť efekty, ktoré sa prejavujú v EPR spektrách v dôsledku prítomnosti lokálnych magnetických polí. Miestne magnetické polia zase odrážajú vzor magnetických interakcií v skúmanom systéme. Metóda EPR spektroskopie teda umožňuje študovať tak štruktúru paramagnetických častíc, ako aj interakciu paramagnetických častíc s prostredím.
EPR spektrometer je určený na zaznamenávanie spektier a meranie parametrov spektier vzoriek paramagnetických látok v kvapalnej, pevnej alebo práškovej fáze. Používa sa pri implementácii existujúcich a vývoji nových metód na štúdium látok metódou EPR v rôznych oblastiach vedy, techniky a zdravotníctva: napríklad na štúdium funkčných charakteristík biologických tekutín zo spektier spinových sond, ktoré sa do nich zavádzajú. v medicíne; na detekciu radikálov a určenie ich koncentrácie; pri štúdiu intramolekulárnej mobility v materiáloch; v poľnohospodárstve; v geológii.
Základným zariadením analyzátora je spektrometrická jednotka - spektrometer elektrónovej paramagnetickej rezonancie (EPR spektrometer).
Analyzátor poskytuje možnosť študovať vzorky:
- s regulátormi teploty - systémy na reguláciu teploty vzoriek (vrátane tých v teplotnom rozsahu od -188 do +50 ºС a pri teplote kvapalného dusíka);
- v kyvetách, ampulkách, kapilárach a skúmavkách pomocou systémov automatickej výmeny vzoriek a dávkovania.
Prevádzkové vlastnosti EPR spektrometra
Paramagnetická vzorka v špeciálnej bunke (ampule alebo kapiláre) je umiestnená vo vnútri pracovného rezonátora umiestneného medzi pólmi elektromagnetu spektrometra. Elektromagnetické mikrovlnné žiarenie konštantnej frekvencie vstupuje do rezonátora. Rezonančná podmienka sa dosiahne lineárnou zmenou intenzity magnetického poľa. Na zvýšenie citlivosti a rozlíšenia analyzátora sa používa vysokofrekvenčná modulácia magnetického poľa.
Keď indukcia magnetického poľa dosiahne hodnotu charakteristickú pre danú vzorku, dôjde k rezonančnej absorpcii energie týchto kmitov. Konvertované žiarenie potom ide do detektora. Po detekcii sa signál spracuje a privedie do záznamového zariadenia. Vysokofrekvenčná modulácia a fázovo citlivá detekcia premieňa signál EPR na prvú deriváciu absorpčnej krivky, v podobe ktorej prebieha registrácia spektier elektrónovej paramagnetickej rezonancie. Za týchto podmienok sa tiež zaznamenáva integrovaná absorpčná línia EPR. Príklad zaznamenaného rezonančného absorpčného spektra je znázornený na obrázku nižšie.
